人脐静脉内皮细胞分离培养的改进及其鉴定

《人脐静脉内皮细胞分离培养的改进及其鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、人脐静脉内皮细胞分离培养的改进及其鉴定作者：张小燕梁朝赵林张威李芊崔伟光【摘要】目的改进静脉内皮细胞原代培养的方法，提高体外培养血管内皮细胞的成功率。方法采用5号带柄一次性静脉输液针灌注消化液，分别用0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶消化脐静脉内膜，比较三种酶液消化的结果，并在倒置相差显微镜下观察其形态特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。结果0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶的最佳消化时间分别为15min，10min，12min。倒置相差显微镜下观察内皮细胞为单层生长，鹅卵石样镶嵌排列。免

2、疫组织化学检测表明细胞内有Ⅷ因子相关抗原。结论胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，且0.1%胶原酶消化12min获得的细胞数量多，成活率高。【关键词】人脐静脉内皮细胞细胞培养分离改进Improvementofseparation，cultureandidentificationofhuman【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheprimaryculturemethodofehdothelialcellsfromhumanumbilicalvEinandimprovetherateofsucc

3、essfulcultureinvitro.Methods0.125%，0.25%trpsinand0.1%collagenaseanumbilicalvEInbyusingdisposableveintransfusionneedleNo.5，afterorphologyandimmunohistochemistryunderinvertedmicroscope.ResultsTheculturedcellshadacobblestoneappearanceonolayergroanyendothelialcellsafterdi

4、gestedby0.125%，0.25%trpsinand0.1%collagenasefor15minutes，10minutes，12minutesrespectively.ConclusionThecollagenasehumanumbilicalvein.【Keyanumbilicalveinendothelialcellscellcultureseparationimprovement血管内皮细胞具有多种生理功能，能产生和分泌许多生物活性物质，在维持血管舒缩，抗凝血等方面起重要作用。体外血管内皮细胞的成功培养是研究内皮细

5、胞功能及其在各种疾病发生发展中所起作用的基础。本文报告利用健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带，采用改进的灌流消化法［1］分离脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC）成功传代培养并予鉴定，方法可靠，简便易行，有利于后续实验研究的进行。1材料与方法1.1标本采集在无菌条件下取正常妊娠足月分娩的新生儿脐带（长于20cm）后，去除脐带血管中的残余血液，放入含青、链霉素的磷酸盐缓冲液PBS中，6h内行脐静脉内皮细胞分离、培养。1.2试剂RPMI1640培养基（美国GIBCO公司），新生小

6、牛血清（杭州四季青生物公司），Ⅰ型胶原酶（美国GIBCO公司），胰蛋白酶(美国GIBCO公司)，兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。1.3仪器Ⅱ级生物安全柜（苏净集团安泰公司），CO2培养箱(日本SANYO)，倒置荧光显微镜(重庆光学仪器厂)。1.4试剂配制RPMI1640完全培养液：20%新生小牛血清，80%RPMI1640，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。Ⅰ型胶原酶溶液：用不含Ca2+、Mg2+的Hanks液配制，0.22μm滤膜滤过除菌，保存于-20℃。1.5人脐静脉内皮细

7、胞原代培养无菌条件下取新生儿脐带，在Ⅱ级生物安全柜内剪去钳痕、血肿、凝血块阻塞部分，分成20cm一段，采用5号带柄一次性静脉输液针吸取36℃预热双抗PBS，插入脐静脉断端，同时结扎固定针体，反复将静脉内残血冲洗干净，再用血管钳夹闭脐带另一端，然后分别注入所配制0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶消化液，使管腔充盈，37℃，作用6、8、10、12、15、17min；松开一端血管钳，收集脐静脉内的消化液，然后注入含10%新生小牛血清的RPMI1640培养液再次冲洗管腔，以获得更多的内皮细胞；将消化液和冲洗液一并注入离心管，

8、800r/min，离心5min，弃上清，加入RPMI1640培养液，吹打均匀，制成细胞悬液，按2×105个细胞/瓶接种于25cm2一次性培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。24h后更换培养液去除未贴壁细胞，然后每隔24h半定量换液一次至细