两株猪源刚地弓形虫的分离及其生物学特性的研究

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1、干尚尚：两株猪源刚地弓形虫的分离及其生物学特性的研究!两株猪源刚地弓形虫的分离及其生物学特性的研究研究生：王尚尚导师：陶建平教授中文摘要刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种细胞内寄生原虫，在分类上隶属顶复门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoasida)、真球虫目(Eucoccidia)、弓形虫科(Toxoplasmatidae)、弓形虫属(Toxoplasma)。弓形虫呈世界性分布，人和200多种动物都可感染，猫是终末宿主，人及其它动物均为中间宿主。弓形虫病对人畜的危害很大，孕妇感染弓形虫后导致早产、流产、胎儿发育畸形，是当今致畸胎的四大原因之

2、一，也是免疫功能低下患者(如AIDS病人等)死亡的主要原因。动物感染很普遍，多数呈隐性感染，但猪可大批发病，死亡率高，给养猪业造成巨大的经济损失。’弓形虫的传播途径包括先天性感染和获得性感染。人类的感染多数为获得性感染，因生食含包囊的肉制品所致。猪肉是我国居民普遍喜食的肉品，养猪业是我国畜牧业中的支柱产业。受弓形虫感染的猪肉可能是人体弓形虫病的一个重要传染源。因此，开展对猪源弓形虫虫株的研究不仅有助于对猪弓形虫病流行特征的了解以及诊断与防治，也有助于掌握弓形虫的传播规律，从而制定公共卫生策略。为此，本文开展了以下研究。1、弓形虫PCR检测方法的建立国际标准株RH株经腹腔接种IC

3、R小鼠，3"--5d后采集小鼠腹水，经CF．11纤维素柱纯化速殖子，提取虫体DNA。以B1基因和529bp重复片段序列做为靶点基因，分别进行了单基因和双基因PCR扩增，并优化PCR反应体系。结果表明529重复片段比B1基因的敏感性高10倍，前者相当于可检测0．9个速殖子，后者可检测9个速殖子；双重PCR可检测到约90个速殖子。2、猪源弓形虫虫株的分离对临床上出现高温、呼吸困难等症状以及剖检在肝脏、肺脏、淋巴结、肠道等有出血、坏死等病变的兽医院门诊病猪进行了弓形虫检测。从25例病死猪中检出5例阳性，阳性率达20％。对检测为阳性的病死猪取脏器组织用ICR小鼠传代，进行虫体分离。取死

4、亡小鼠腹水染色镜检，可见较多月牙形、半月形或椭圆形的虫体，还可见假包囊。成功分离出2株虫体，分离成功率为40％。两株分离株分别命名为YZ一1(家养野猪)和YZ一2(商品猪)。3、两株猪源刚地弓形虫的鼠毒力分析将2株分离株在小鼠体内连续传代，且传代时每次经腹腔接种的虫体数相同，直至虫扬州入学硕士学位论文体在小鼠稳定寄生。以RH株为参考株，每个虫株各设5个剂量组，分别经腹腔接种梯度稀释的速殖子。结果表明分离的2株猪源弓形虫分离株对小鼠的毒力与RH株相同，经腹腔接种10个速殖子致小鼠100％的死亡，且死亡发生规律与RH株相似，因此将这2株猪源弓形虫分离株鉴定为鼠毒力株。但2株猪源弓形

5、虫分离株GRA6基因的克隆与序列分析显示，GRA6基因序列中同时存在15bp和3bp片段的缺失，与鼠弱毒株(BEVERLEY)的完全一致。4、两株猪源刚地弓形虫的基因型分析采用PCR—RFLP方法，以GRA6，PKl，SAG2，c29—2，删G3，BTUB，c22．8，L358，Apico等9个常用分型基因位点对两株猪源弓形虫分离株进行基因型分析，结果显示，分离的两株猪源弓形虫的基因型完全一致，为非经典型(atypical)，与报道的中国猫源株中Chinesel基因型完全一致。另外，两株猪源弓形虫分离株在PKl、GRA6和SAG2三个基因位点上的基因型均为II型，且在进化树分析

6、中也显示与基因II型聚合在一个分支。5、两株猪源刚地弓形虫的ITS区序列分析对两株猪源弓形虫分离株的ITS及5．8S基因进行了克隆及序列分析，并与GenBank上登录的RH株及其他弓形虫株的ITS序列进行比较，结果表明弓形虫种内ITS序列存在极少变异，具有高度保守性。对弓形虫及外源参考群的ITS和ITS．1序列构建N．J进化树分析，结果显示ITS序列适于弓形虫与其他原虫的种间鉴定，但不适合用于弓形虫种内遗传变异的研究。关键词：猪；刚地弓形虫；分离；鼠毒力分析；基因型；ITS————————』．堂堂!堕堡鲨塑旦!丝曼垄皇塑坌宣壑基圭塑堂壁丝丝婴窒三Isolationandhara

7、cterizationoftwo‘一●strainsfrompigsM．S．candidate：Shang-shangWangAdvisor：Prof．Jian-pingTaoAbstractToxoplasmagondiiisanobligateintracellularprotozoanthatbelongstothephylumApicomplexa，classSporozoasida，orderEucoccidia，familyToxoplasmatidae，genusToxopla