牙鲆免疫应答的温度效应及黏膜免疫分子的研究

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1、中国海洋大学博士学位论文牙鲆免疫应答的温度效应及黏膜免疫分子的研究姓名：许国晶申请学位级别：博士专业：水产养殖指导教师：战文斌；绳秀珍201206牙鲆免疫应答的温度效应及黏膜免疫分子的研究摘要近二十年来，随着分子生物学和免疫学技术的发展，渔用疫苗的研发进入了快速发展的阶段，给养殖鱼类疾病免疫防治带来了希望。由于免疫防治的效果受到多种因素的影响和控制，所以要达到理想的病害免疫防治效果，需要考虑鱼体自身免疫系统组成特点及免疫应答规律。鱼类黏膜免疫系统是鱼类抵抗病原入侵的第一道防线，而免疫应答受环境因素尤其温度的影响非常显著，因此，深

2、入研究温度对鱼类免疫应答的影响规律及鱼类黏膜免疫分子特性、功能是开展鱼类病害免疫防治的前提和基础。本论文在国家自然科学基金项目资助下完成，分析了不同温度下牙鲆系统及黏液免疫应答的水平变化；纯化分析了牙鲆皮肤黏液免疫球蛋白(Ig)，并制备了其单克隆抗体，应用该抗体研究了牙鲆黏液Ig与血清Ig、表面抗体阳性细胞的关系；另外克隆了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(plgR)基因eDNA全序列，RT-PCR分析该基因在不同组织内的差异表达情况，并对其进行体外表达，研究了重组蛋白的特性；同时研制出牙鲆pIgR多克隆抗体，并利用该多抗鉴定了皮肤黏液中

3、的受体蛋白，为探讨plgR的特性及功能奠定了基础。具体研究内容和结果如下：(1)牙鲆免疫应答的温度效应研究。应用流式细胞术及间接酶联免疫吸附(ELISA)研究了不同水温(9℃、15℃、21℃和26℃)下用灭活LCDV疫苗腹腔注射牙鲆后的系统免疫应答变化，结果表明，外周血、脾及前肾组织中表面抗体阳性(Smlg+)细胞比例及血清中抗体水平在21℃下变化最大，低温(9℃和15℃)时变化缓慢，且峰值水平较低；26℃下峰值低于21℃温度时峰值。同时应用ELISA检测了皮肤黏液中特异性抗体水平的变化，分析了温度对牙鲆皮肤黏液抗体产生的影响。

4、结果表明，皮肤黏液中特异性抗体水平在21℃水温下OD值上升最快，且达峰值时间最早；低温(9℃和15℃)时变化缓慢，且峰值水平较低。以上结果说明牙鲆免疫应答与温度密切相关，在最适温度21℃时变化最大，低温或高温时免疫应答受抑制。(2)黏液Ig的分离纯化。采用饱和硫酸铵分步盐析牙鲆黏液后，应用AKTAprime蛋白质纯化系统，通过凝胶柱SephacrylS-300、HiTrapDEAESepharoseFastFlowColumn两种预装层析柱纯化牙鲆黏液Ig，并进行了分子量的初步测定。结果表明，饱和硫酸铵分步盐析、Sephacry

5、lS-300和DEAESepharoseFastFlowColumn三种方法结合可特异性的分离牙鲆黏液Ig，纯度高，变性电泳SDS．PAGE检测分析得出纯化获得牙鲆黏液Ig的重链和轻链分子量分别为72kDa和26kDa，非变性电泳Native．PAGE结果显示纯化的牙鲆黏液Ig分子量为798kDa。(3)抗牙鲆黏液Ig单克隆抗体的制备及应用。以纯化的牙鲆黏液Ig为抗原免疫Balb／C小鼠，采用单克隆抗体技术获得了8株抗牙鲆黏液Ig的单克隆抗体(1A-M2、1C—M10、1E—M2、1F—M7、3F—M9、3G—M5、8B-M4、

6、8E—MS)。Westernblotting结果显示：8株单抗识别的抗原决定簇均位于牙鲆黏液Ig的重链(72kDa)上。应用抗牙鲆黏液Ig单抗(1A．M2)及之前实验室制备的抗血清Ig单抗2D8，通过流式细胞术同时分析了牙鲆各组织中的Smlg+细胞的比例，1A．M2孵育结果分别为外周血细胞(38．64％)，脾(23．6％)，皮肤(16．56％)和鳃(6．26％)，2D8孵育结果分别为外周血细胞(48．89％)，脾(33．7％)，皮肤(15％)和鳃(6．02％)，说明抗牙鲆黏液Ig单抗及抗血清Ig单抗均可与Smlg+细胞反应，黏液

7、Ig与血清Ig至少具有部分抗原相似性；另外应用制备的1A．M2及抗血清Ig单抗2D8通过Westernblotting分析牙鲆黏液Ig及血清Ig抗原性差异，结果表明1A—M2只与黏液Ig反应，不与血清Ig反应，而单抗2D8可与黏液Ig与血清Ig反应，说明黏液Ig与血清Ig存在抗原性差异。(4)牙鲆pIgR基因eDNA序列的克隆、表达及特性分析。通过RACE技术获得pIgRcDNA序列，全长1384bp，含一个1005bp的开放阅读框(ORF)，编码335氨基酸，蛋白分子量大小为37．6kDa。同时，利用半定量RT-PCR分析了p

8、I冰基因在牙鲆不同组织内的转录差异情况，结果显示该基因在肠、肝脏、鳃和皮肤中表达量最高，脾和前肾次之，在胃和肌肉中转录水平最低，说明该基因与牙鲆黏液Ig转运密切相关。同时成功地构建了表达牙鲆pIgRORF的重组质粒，诱导表达后，得到包涵体形式的plgR重组蛋白(