人脐带间质干细胞来源的exosomes对肝星状细胞活化的抑制研究

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1、分类号UDCR329．4616@密级．．坌五编号10299S1114024江-薄大擎硕士学位论文MASTER’SDISSERTATIoN细胞活丝的控剑巫究学科专业!逝压捡验途逝堂作者姓名奎里塑指导教师垡睡塾拯答辩日期2014．06．10分类号墅2窆：垒UDC616编号!堡2窆垒墨!!!垒Q2垒硕士学位论文人脐带间质干细胞来源的exosomes对肝星状细胞活化的抑制研究THEINHIBITORYEFFECTOFEXOSOMESDERIVERDFROMHUMANUMBILICOLCORDMESENCHYMALST

2、EMCELLSONACTIVATEDHEPATICSTELLATECELLS作者姓名：李里明指导教师：钱晖教授小组成员：严永敏副教授毛飞副教授申请学位：医学硕士学科专业：临床检验诊断学论文提交日期：2014年4月28日论文答辩日期：2014年6月10日学位授予单位：江苏大学学位授予日期：2014年6月答辩委员会主席：许文荣教授基金资助：国家自然科学基金项目(81200312，81272481，31340040)；江苏省自然科学基金青年基金项目(BK2012288)；江苏高校优秀科技创新团队(苏教乖：[-(20

3、13)10号)；江苏省医学领军人刁’与创新团队(U201117l；独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：≮蓼19q日期：加悼年多月[12日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本

4、人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于不保密。学位论文作者签名：誊留l咽指导教师签名：∞1牛年易月f．，日》叫陴6月fp日江苏大学硕士学位论文摘要目的肝星状细胞(HSC)在肝纤维化的发展进程中起关键作用，而前期研究已证实人脐带间质干细胞(hucMSC)来源的囊泡(exosomes)对四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝脏纤维化具有修复效果，在此基础上本课题着重探讨hucMSC来源的exosomes(hucMS

5、C．ex)对HSC活化的抑制作用及其可能机制。为hucMSC．ex临床治疗肝脏纤维化提供新的实验依据和思路。方法体外研究采用重组人转化生长因子pl(TGF—p1)诱导人肝星状细胞系LX2活化，再分别加入hucMSC．ex、RNase．ex(经RNA酶处理后的hucMSC．ex)及HFL1一ex(人肺成纤维细胞来源的exosomes)作用48h，观察exosomes作用前后LX2细胞形态学变化，通过RT．PCR及Westernblot技术检测作用前后LX2活化相关指标，如0【．平滑肌肌动蛋白(0【．SMA)、成

6、纤维细胞激活蛋白O【(FAP．0【)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMPl)及TGF．131／Smad信号通路的相关基因或蛋白表达变化。体内研究构建CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化模型，损伤6周后肝脏定点注射hucMSC．ex，RNase—ex及HFLl-ex，以注射PBS为对照组。3周后收集各组小鼠血清和肝脏组织，通过连续监测法检测血清中谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)的含量；组织免疫组化、免疫荧光、病理HE染色、Masson’S三色染色、RT—PCR及Westernblo

7、t等技术l人脐带问质干细胞来源的exosomes对肝星状细胞活化的抑制研究检测肝组织中的炎症浸润情况，HSC活化相关蛋白0t．SMA、FAP．Ot及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，以及肝纤维化相关TGF．pl、磷酸化smad2(p—smad2)、纤维连接蛋白(Fibronectin)及胶原纤维的表达变化，体内外实验综合评价hucMSC．ex通过对HSC活化的抑制而达到修复肝纤维化的效果及可能机制。结果体外研究显示，重组人TGF—pl诱导后，LX2细胞形态由不规则星状形态转变为纺锤形，两极拉长似成纤维细胞；同

8、时RT．PCR及Westernblot结果显示诱导后LX2细胞中的O【一SMA、FAP．0【、MMP2及TIMPl表达明显上调。加入hucMSC．ex作用后，LX2细胞的纺锤样形态发生逆转，0【．SMA、FAP—O【、MMP2及TIMPl的表达下降。而RNase—ex及HFLl．ex组的LX2细胞形态上大部分同TGF．p1组类似，呈成纤维细胞样：且仍高表达0c．SMA及FAP．0t。同样MTT实验提