倍他米松多克隆抗体的制备及其elisa分析方法的建立

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1、万方数据分类号：密级：T$207．3单位代码：10086学号：2Q132Q2Q!Q垒倍他米松多克隆抗体的制备及其ELISA分析方法的建立PreparationofPolyclonalantibodyagainstBetamethasoneandtheEstablishmentofELISAmethod学位申请人：郭璐指导教师：王向红教授学科专业：农产品加工及贮藏工程学位类别：工学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一六年五月二十九日⑩沥髟名聋万方数据硕士学位(毕业)论文倍他米松多克隆抗体的制

2、备及其ELISA分析方法的建立学位申请人：指导教师：学科专业：学位类别：授予单位：答辩日期：郭璐王向红教授农产品／jn-r-及贮藏工程工学硕士河北农业大学二。一六年五月二十九日万方数据独创性声明7本人声明所璺交的学镟论文是本人在导师指导下进符的研究工作及取得的研究成果。据我所知。除、r文中特别加以标注和致谢的地方夕卜，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑韭垒些盘堂或其他教育执构的学位或证书谳使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明

3、并表示谢意。学位论文侔者签名：丐p海签字日期：一>。，易每j_月每秒Et学位论文版权使用授权书本学位论文作肴完龛了解冱韭塞逛．太茔有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交沦文的复印件幕1磁盘，允许论文被套阅和衡阕。本人授权塑垄壅堡太堂可以将学位论文的全部域部分内容编入有：必数据痒进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密质适用本授权书)学位论文作辫签名：蕲培导师签名：识锄2签字目期：抛，占年j-月如日签字日期：如∥年P周≥。困学

4、位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：万方数据摘要倍他米松是一种肾上腺皮质激素类药物，有较强抗炎、抗过敏和抗休克的功效。在畜牧业生产中，由于倍他米松可以提高饲料转化率，促进畜禽生长，因此得到了广泛的应用，进而为畜产品加工的安全问题产生不良影响。人体通过动物性食品摄入过量的倍他米松可导致代谢紊乱、血压增高、骨质疏松等，可能会给儿童的正常生长带来较严重的不利后果。因此建立动物性食品中倍他米松快速检测法有很强的现实意义。本研究采用生物化学基本理论合成免疫原，免疫动物产生抗体，建立ELI

5、SA分析方法，并且对方法的特异性、灵敏度、准确性等进行了评价，并通过HPLC方法进行了确证，具体研究结果如下：倍他米松抗体的制备：倍他米松(BET)与琥珀酸酐进行反应，后采用活化酯法与牛血清蛋白(BSA)偶联制备免疫原、与卵清蛋白(OVA)偶联制备包被原，通过紫外扫描和SDS．PAGE法判定偶联取得成功；免疫动物获得抗血清，经ProteinA．Sepharose4B方法对抗血清进行纯化得到多克隆抗体；间接竞争ELISA测定其滴度为102400、ICl5为6．60×10‘5ng／mL和IC50为O

6、．97ng／mL。ELISA方法的建立及其稳定性的验证：通过对抗原抗体反应浓度、缓冲盐浓度、pH值、酶标抗体的浓度等条件进行分析，确定了建立ELSIA分析方法的试验条件为：包被抗原及抗体工作浓度分别为10pg／rnL、纯化抗体稀释倍数为12800倍，缓冲盐溶液的pH值为7．5，甲醇浓度范围是O％～20％，辣根过氧化物酶标羊抗兔的使用浓度为稀释2500倍；板间变异系数范围为6．77％～28．01％，变异系数随倍他米松浓度的增大而减小，但平均变异系数为14．27％，在允许范围内，说明其稳定性较好。抗

7、体特异性验证：选取倍他米松结构类似物地塞米松、氢化可的松、醋酸氟轻松做交叉反应，其交叉反应率依次是2．51％、4．16％和0．25％。样品基质影响的消除：在样品基质影响消除试验中，采用直接稀释法；针对猪肉、牛肉等肌肉样本和牛奶样本，经简单提取离心后，上清液用PBS缓冲液20倍稀释，即可消除基质的影响；针对肝脏样本的基质，上清液用PBS缓冲液40倍稀释，即可降低色素的影响，消除基质的干扰。提取液稀释后的标准曲线与标准曲线的对比，吻合程度高。方法确证性试验：本试验以中国药典所采用的方法为基础，建立了

8、分离检测倍他米松的高效液相色谱法；在一定的状态下对猪肉、牛肉以及虾肉等实行加标回收测试，结果各组分回收率分别在72．73％--一93．06％之间，ELISA检测结果与HPLC检测结果有较好的相关性y=1．033x．1．057R2=O．980，说明ELISA分析方法效果良好。综上所述，本试验成功制备出抗BET抗体；确定了建立ELSIA分析方法的试验条件；验证了抗BET抗体具有较高的特异性；对ELISA方法进行了确证性试验，结果表明建立的ELISA分析方法对样品检测的最终数据是精准的，方法可行，灵敏