单精注射制备转基因猪胚胎技术的研究

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1、万方数据TheresearchofproductionofporcinetransgenicembryosbyintracytoplasmicsperminjectionByHuXiaoRuiAThesisSubmittedtoZhejiangNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheMasterDegreeofAgronomySupervisedbyProf．PanJian-zhiCollegeofChemistryandLifeScienceZhejiangNormalUniversityJinhua

2、321004，ER．ChinaCompletedinDecember,2013CommencementinDecember,2013万方数据浙江师范大学学位论文诚信承诺书我承诺自觉遵守《浙江师范大学研究生学术道德规范管理条例》。我的学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均己明确注明并详细列出有关文献的名称、作者、年份、刊物名称和出版文献的出版机构、出版地和版次等内容。论文中未注明的内容为本人的研究成果。如有违反，本人接受处罚并承担一切责任。承诺人(研究生)：剞a与瑶指导教峨易纫眺万方数据单精注射制备转基因猪胚胎技术的研究摘要转基因动物研究开始于上个世纪七十年代

3、末，是一项能对家畜基因组进行修饰的有效技术，对改进畜牧业生产效率有重大的作用。目前转基因技术有原核注射法、精子介导法、逆转录病毒感染法和体细胞移植法等。将精子载体转基因法(SMGT)与单精注射(ICSI)结合制备转基因动物是一种新的转基因技术，研究历史较短，但其可行性和高效性已在多个物种得到试验证实。BAC作为转基因载体，可携带的基因包括上下游调控序列，可以和转录酶、转录因子等作用，转基因将能遵守基因固有的表达机制。所以将ICSI．SMGT技术与BAC转基因技术相结合制备转基因猪，为我们今后制备大片段转基因猪提供了新方法，具有广阔的应用前景。为成功制备转基因猪胚胎，本课题将从猪卵

4、母细胞延迟保存与体外培养和以单精注射技术与BAC载体技术相结合为目标的两个方面进行研究。第一方面，建立猪卵母细胞体外延迟保存体系，拟设计先将卵母细胞分别放入TCMl99(含HEPE)、PBS缓冲液(无Ca2+和M92+)和DMEM低糖培养基中37。C保存6．8h后转入成熟培养液与瞬时放入成熟培养液的对照组作比较，统计分析试验组之间成熟率，卵裂率和囊胚率的差别。其中对照组成熟率为78．19％，卵裂率为55．87％和囊胚率尾12．23％；TCMl99试验组成熟率为76．25％，卵裂率为55．00％和囊胚率为12．12％；PBS试验组成熟率为49．00％，卵裂率为22．00％和囊胚率为

5、2．27％；DMEM试验组成熟率为47．50％，卵裂率为20．50％和囊胚率为2．43％。比较结果发现TCMl99试验组与对照组无显著差异，进而将TCMl99试验组的胚胎进行胚胎移植，母猪受孕后产下11头小猪，小猪健康状况良好，体貌特征与自然受孕分娩的小猪无差异，所以TCMl99(含HEPE)可以作为猪卵母细胞体外延迟保存液。为完善体外延迟保存体系，确立更好的延迟保存条件，设计将卵母细胞放入TCMl99(含HEPE)后分别在4。C、25℃和37。C中保存6．8h后转入成熟培养液，统计分析各试验组之间成熟率，卵裂率和囊胚万方数据率的差别。其中4。C试验组成熟率为19．00％，卵裂率

6、为9．5％和无囊胚；25。C试验组成熟率为33．00％，卵裂率为15．oo％矛n无囊胚；37。C试验组成熟率为76．50％，卵裂率为54．50％和囊胚率为13．76％。比较结果得出37。C为理想的体外延迟保存温度。这一研究为实现卵母细胞发育初始时间的可控性提高可能。第二方面，为实现单精注射技术与BAC载体技术相结合制备转基因猪胚胎的目标。需要利用ICSI技术成功制备出猪胚胎。首先将精子以工作3s，间隔3s，功率3w总计60s的参数进行超声波断尾。再利用ICSI技术将精子注入卵母细胞并以170V，901as条件下电激活受精卵，最后观察胚胎的发育状况。为实现成功制备大片段转基因猪胚胎

7、提供了技术基础。本研究建立了体外延迟保存猪卵母细胞的体系，并建立一种以单精注射为基础，适用广、高效的导入外源基因的转基因技术，并通过ICSI技术向卵母细胞内导入大片段外源基因，制备转基因猪胚胎。关键词：猪卵母细胞；体外延迟保存；单精注射；细菌人工染色体；转基因猪胚胎11万方数据THERESEARCH0FPRODUCTIONOFPORCINETI之ANSGENICEMBROYSBYINTRACYTOPLASMICSPERMINJECTl0NABSTRACTThestudyofani