dna甲基化与x染色体失活对g6pd酶活性的影响研究

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1、南方医科大学20ll级硕士学位论文DNA甲基化与X染色体失活对G6PD酶活性的影响研究hlnuenceofDNAmethylationandXcllromosomeinactivationon91ucose一6一phosphatedeh)r出ogenaSeactiVity课题来源：国家自然科学基金青年基金(30900806)学位申请人导师姓名专业培养培养姣柱名称类型层次学院答辩委员会主席答辩委员会委员王瑾韦相才教授徐湘民教授遗传学学术型硕士基础医学院康铁邦教授徐湘民教授张镇海教授赵存友教授赵虎教授2014年4月22日广卅硕士学位论文DNA甲基化与X染

2、色体失活对G6PD酶活性的影响研究硕士研究生：王瑾导师：韦相才教授、徐湘民教授摘要背景与目的葡萄糖．6．磷酸脱氢酶(gkose一6一pbospllatedehydrDgellase，G6PD)缺乏症是人类最常见的酶缺陷病之一，全球约有4亿入受累。高发地区为非洲、东南亚和地中海沿岸国家等。在我国南方地区也较多见，G6：肋突变携带率高达16％。G6PD缺乏症主要是由于G6肋基因发生点突变所引起的，目前已经发现了160多种致病点突变。主要临床表现有蚕豆病、先天性慢性非球形细胞溶血性贫血(cNsHA)、新生儿黄疸、药物或感染所导致的急性溶血。世界卫生组织(w

3、H0)规定G6PD酶活性为衡量G6PD缺乏症严重程度的重要指标。G6PD缺乏症为x连锁不完全显性遗传病，主要累及男性个体，男性半合子G6PD酶活性缺乏显著；对于女性纯合子或者双杂合子也可发病；而女性杂合子酶活性有较大的变异度，一般情况下受累者无临床表现，但研究发现部分杂合子也可表现为酶缺乏、蚕豆病、溶血性贫血等临床症状，这种现象尚不能从经典的G6PD突变机制中得到解答。G舒，D基因的表达主要受该基因的特殊突变类型、外显子剪接沉默子、转录因子及表观遗传学等方面的调控。对于女性杂合子来讲，DNA甲基化和X染色体失活或许对其G6PD酶活性异质性的现象起着主

4、要的作用。DNA甲基化，特别是靠近转录起始位点的CpG岛的高甲基化状态，可以沉默基因的表达，并发现与某些疾病的发生、发展有密切的联系。乃九fD，D等研究证实小鼠的G6_肋基摘要因5，肩动子区域的甲基化可以调控该基因的表达，在失活的X染色体上G6PD基因部分位点是甲基化的，而在未失活的X染色体上G卯D基因5’端的部分CpG位点是未甲基化的。然而人类的全基因组甲基化或G卯D基因的甲基化对G6PD缺乏症表型的影响鲜有报道。另一方面，由于人类X染色体的随机失活，女性杂合子的体细胞通常被认为是一个嵌合体。在某些情况下，X染色体受遗传因素的影响可以发生非随机失活

5、。携带野生型等位基因的偏移失活通常会引起突变基因的表达，这种女性通常会产生如男性突变半合子的酶缺乏症状。因此，我们假设X染色体的非随机失活是导致同种基因型的女性杂合子酶活性各异的关键所在。虽然也有前人报道称X染色体的偏移失活足导致老年女性杂合子酶缺乏的重要原因。然而他们并没有验证失活的X染色体所携带G6尸D基因是突变型还是野生型。迄今为止，尚未有大人群的研究证实x染色体失活与G6PD缺乏症表型的关系。因此，造成G舒D杂合子表型异质性的原因还需进一步的深入研究。本研究主要是采用甲基化敏感性内切酶印口II删印I结合荧光偏振的检测方法对全基因组DNA甲基化

6、进行定量；采用重亚硫酸氢钠处理DNA后测序的方法定量G6PD基因启动子区15个CpG位点的甲基化：并通过毛细管电泳检测基因型相同而酶活性异质性的G6PD突变女性杂合子的x染色体失活类型，继而分析DNA甲基化及x染色体失活与G6PD酶活性之间的关系。本研究旨在为进一步阐明DNA甲基化及x染色体失活对G6PD酶活性的影响，为临床上该类疾病的诊断、预防和治疗提供参考，同时也为其他X连锁疾病的研究提供借鉴。材料与方法l。研究对象：从珠海市妇幼保健院收集到基因型、酶活性已知的家系DNA样本139例，每个家系中包括1个G6PD女性杂合子及其儿子，其中，女性杂合子

7、年龄段为21．43岁，其基因型为c．1376G>T68例，c．1388G>A71例。从东莞市妇幼保健院随机收集到212例女性血液样本，经G6PD活性测定及G卵DII硕士学位论文基因型检测、测序共得到基因型野生型、酶活性正常的健康样本167例，其中新生儿组53例，18．59岁65例，老人组66例。2．G6PD酶活性、基因型检测：对于家系样本，酶活性及基因型指标分析由珠海市妇幼保健院完成。对于随机收集的212例女性血液样本，通过G6PD佑PGD比值法检测G6PD酶活性，酚／氯仿法提取血液DNA，变性高效液相色谱法(P剧DHPIC)检测G6PD常见突变型，

8、对于检测峰型异常的酶活性正常样本通过DNA测序排除未知突变。本研究通过医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同