低能离子诱变选育华根霉高产l-乳酸菌株的研究

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1、薯类羡—螋L、瘩微震业大学学位论文．』鲣鲤—鼬3QZ!Q11Q鲣低能离子诱变选育华根霉高产L一乳酸菌株的研究st寥沁sofBreedingHigh-yieldL．1acticacidMutantStrainofRhizopusChinensisbyLowEnergyI彻Impla⋯ntation“硎究生：．固型!植指导教师：捏圣么麴援合作指导教师：基蒸塞副教援申请学位门类级别：理堂亟±专业名称：生物物理堂研究方向．一生塑物理逝撞盔生堑友洼所存学院：生金科堂堂瞳答辩委员会主席2006年6月誉＼～、摘要为了满足乳酸尤其是对L．乳酸的大量需求，不断地发掘自然微生

2、物资源中的优良菌株并对其进行诱变育种工作尤为重要。本研究以一株产L．乳酸的野生型华根霉(Rhizopuschinensis)为出发菌，对该菌株适宜产酸的条件进行了研究，然后以10kev氮离子对出发菌L．乳酸产率进行诱变，以期获得高产的L．乳酸菌株。同时为了比较出发菌株和突变菌株在分子水平的差异，利用108条RAPD随机引物对出发菌株和突变菌株进行了RAPD比较分析。主要研究结果如下：1．出发菌华根霉适宜产酸的条件为：葡萄糖90‰、(NH4)2s042％0、KH2P040．6‰、MgS04·7H20O．25‰、ZnS04·7H20O．0590、CaC0350

3、．0‰pH值自然，接种量在5％左右，34℃，200rpm的培养条件下，可获得较高的L．乳酸产量(28．sg／L)。2．选用能量10kev的N+离子，注入剂量为0．26×1015ions／cm2～2．86×1015ions／cm2对出发菌进行诱变，存活曲线与文献报道的“马鞍型”曲线基本符合。注入诱发高产L．乳酸突变的适宜剂量为1．30×1015ions／era20筛选获得的突变株RC．HI3L．乳酸含量为33．79／L，比出发菌株提高17％。经多次传代表明该菌株遗传稳定性较好。3．利用108条随机引物对出发菌株和突变菌株进行了RAPD比较分析，83条引物在两

4、池具有扩增产物，其中3条引物(S193，$271，$382)在两池间表现多态性，有多态性扩增的引物频率为2．78％，且多态性稳定，重复性较好。4．选择其中2条(S193，$271)差异性片段进行克隆和测序，用BLAST程序在NCBI上进行比对，发现$271引物所扩增的序列部分与稻瘟病菌假设蛋白(Magnaporthegriseahypotheticalprotein)的序列有86％的同源性，与烟曲霉(AspergillusfumigatusAf293)DNAreplicationlicensingfactor具有79％的同源性。S193引物所扩增的序列经比

5、对未发现有相似序列。关键词：华根霉：L．乳酸；离子注入；RAPD分析AbstraetInordertomeetmassivedemandsofthelacticacidespeciallyL-lacticacid，itisveryimportanttocontinuouslyexplorethefmestraininthenaturalmicroorganismresourcesandoptimizeit．Inthispaper，TheL-lacticacidproducingconditionofRhizopuschinensiswasoptimized

6、．Thenthrough10kevN+implantingintoRhizopuschinensistoobtainhigh-yieldmutant．Simultaneouslyinordertocomparedifferencesbetweentheoriginalstrainandthemutainstraininthemolecularlevel，108primerswereexaminedtoclarifythegeneticbackgroundbyusingrandomlyamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)analysis

7、．Theresultswereasfollows：1．Theoptimalproductionmediumandfermentationconsistedoffollowing：C6H120690％o、nqH4)2S042％o、KH2P04O．6％0、MgS04‘7H20O．25％o、ZnS04‘7H200．05％0、CaC0350．0％o、5％volumeofseeds，34℃，200rpm．Thefinalconcen：trationofL-lacticacidreachedto28，89／L．2．Use10keV0,26x1015ions／cm2～2

8、．86×1015ions／cm2doses．N+dealingwi