转gfp基因体细胞核移植克隆牛胚胎的研究

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1、新疆农业大学硕士学位论文转GFP基因体细胞核移植克隆牛胚胎的研究姓名：邓守龙申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：王安江;余雄20090601转GFP基因体细胞核移植克隆牛胚胎的研究摘要本文对提高转基因体细胞核移植克隆牛早期胚胎发育进行了研究，目的是为了优化体细胞核移植法生产转基因克隆牛胚胎，以克服重构胚胎发育阻断，为提高体外克隆转基因胚胎的质量和数量提供理论基础。本论文设计了五个试验，分别为：试验一探讨了HYA(透明质酸酶)的浓度和作用时间对牛体外成熟卵母细胞脱卵丘及电激活参数对牛孤雌胚胎的影响；试验二试验采用脂质体转染法与电穿孔法，以携带绿色荧光蛋白(GFP)．新霉素

2、抗性(neo．)双标记基因的PMScV质粒转染胎牛耳成纤维细胞为供体与体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚，研究不同转染方法构建供体细胞对重构胚发育的影响，并研究供体细胞的传代次数对转基因重构胚的影响；试验三卵母细胞成熟培养液中添加不同浓度的EGF对转基因核移植胚胎的发育影响；试验四不同强度的电脉冲+乙醇+6．DMAP对牛转基因重构胚的融合和激活，电融合液中钙离子浓度对融合效果的影响；实验五利用以上优化方案生产转基因克隆胚胎，研究转基因重构胚在不同体外发育培养系统与培养体系中的发育效果。试验结果如下：1．体外成熟培养液中添加EGF30ng／mL组卵母细胞成熟率最高，对转基因重构胚的囊胚

3、发育率，以添加EGF20ng／mL组最高。2．不同转染方法转染供体细胞构建重构胚，其囊胚发育率差异不显著(尸>O．05)，但脂质体转染法效果较好。3．传代5次的胎牛耳成纤维细胞做核供体，较有利于转基因胚的发育。4．卵母细胞成熟培养22h，用0．20％HYA作用10min与0．50％HYA作用5min脱卵丘差异不显著(尸>O．05)，优于其他试验组。5．在激活电压1．6kV／cm、201．ts／次、间隔ls，脉冲次数为单次的条件下的激活效果较好。6．应用到体细胞核移植重构胚的融合上得到相同结果，电融合液中钙离子浓度为lmmol／L，囊胚率最高。7．mSOFaa+颗粒细胞单层细胞共培养体系

4、中的转基因囊胚发育率最好。8．负压单层颗粒细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率较好。关键词：牛，转GFP基因，孤雌，核移植，体外发育StudyonTransgenicGFPGeneinBovineEmbryosProductionbySomaticCellNuclearTransferAbstractThisstudywastooptimizeasystemforproductionoftransgenicbovineembryosbynucleartransferofsomaticcells．Firstpurposeistoconfirmtheeffectthatsomaticcell

5、nucleartransferWasusedatthefield．Secondpurposeistocheckoutblastularatioofsomaticcellnucleartransfer．AndthirdpurposeistoimprovetheenvironmentsoftransgenicbovineembryosandprovidetheoreticbasisoftransgenicbovineembryosqualityandquantityforIVC．ApmScvwithgreenfluorescentprotein-mycophenolateresistanc

6、emarkergenewastransfectedintofetmfibroblastcellsthatWasthedonor．ThematurationofbovineoocyteinvitroWasthereceptor．TheembryocloningWasconstructedbythedonorandreceptor．TheexperimentWastoexamineresearchfuleffectwhichbovineembryoswereproducedwitllParthenogenesisinvitro，Wastoexamineresearchfialeffecto

7、fHYA，differenttimeandconcentrationofoocyteinteractioninvitro．PMs“containingGFPandneo．geneWastransfectedintothecattlefetalaurisfibroblastcellswhichwasthedonorbylipofectionorelectrofusion．ThematurationofbovineoocyteinvitroWasr