白藜芦醇苷抑制磷脂酶a2缓解内毒素性肺损伤的机制研究

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1、重庆医科大学博士学位论文白藜芦醇苷抑制磷脂酶A2缓解内毒素性肺损伤的机制研究姓名：舒仕瑜申请学位级别：博士专业：儿科学指导教师：李廷玉201205重庆医科大学博士研究生学位论文白藜芦醇苷抑制磷脂酶A2缓解内毒素性肺损伤的机制研究摘要第一部分：白藜芦醇苷上调Clara细胞分泌蛋白表达缓解大鼠内毒素休克性肺损伤目的：研究白藜芦醇苷(PD)对内毒素休克大鼠肺组织中Clara细胞分泌蛋白(CCSP)基因和蛋白表达的影响及量效关系。方法：将50只SD大鼠随机分为5组(n=10)：正常对照组(A组)、内毒素休克模型组(B组)、PDlmg·kg。1治疗组(C组)、PDlmg·kg。预防组(D组)和PD对照

2、组(E组)。再将48只SD大鼠随机分为PD治疗组(n-24)和PD预防组(n-24)，每组再随机均分为4个小组(n=6)，分别按lmg·kg～、5mg·kg～、10mg·k91、30mg·kg-1给予PD。采用Real．timePCR法检测各组大鼠肺组织中CCSP、sPLA2和cPLA2的基因表达，采用Westem．blot法检测各组大鼠肺组织中CCSP的蛋白表达，免疫组化法记数各组CCSP阳性细胞数，ELISA法检测各组大鼠血清中CCSP水平，并结合HE染色病理图片观察各组大鼠肺损伤的程度。基金项目：本研究项目由2008年重庆医科大学校办课题(项目号：BYB2007050)资助重庆医科大学

3、博士研究生学位论文结果：与正常对照组相比，内毒素休克模型组大鼠肺组织中sPLA2和cPLA2mRNA表达显著增高，血清和肺组织中CCSP的基因和蛋白表达均明显降低；白藜芦醇苷不仅可显著促进CCSP在正常大鼠肺组织中的表达，还可促进内毒素休克大鼠肺组织表达CCSP，且预防组明显多于治疗组，从而降低肺组织中sPLA2和cPLA2mRNA表达，减轻肺损伤的程度。在观察剂量内，随着PD剂量的增加，CCSP的基因和蛋白表达呈增加的趋势，肺损伤的程度逐渐减轻。结论：CCSP是磷脂酶A2的内源性抑制剂，PD可呈剂量依赖性上调内毒素休克大鼠肺组织中CCSP的基因和蛋白表达，对抗磷脂酶A2的损伤作用，实现肺保

4、护，可能是白藜芦醇苷的重要作用机制之一。关键词：休克，内毒素性，急性肺损伤，白藜芦醇苷，Clara细胞分泌蛋白第二部分：白藜芦醇苷对内毒素诱导的BEAS．2B细胞中CCSP表达和Ca2+浓度的影响目的：探讨白藜芦醇苷(PD)对内毒素(LPS)诱导的人支气管上皮细胞(BEAS．2B)中Clara细胞分泌蛋白(CCSP)基因和蛋白表达以及对Ca：+浓度的影响。方法：培养BEAS．2B细胞，MTT比色法筛选PD和LPS最佳浓度；然后复制LPS诱导的BEAS．2B细胞炎症反应模型，实验分为正常对照组、LPS模型组、LPS+PD组、PD+LPS组、PD对照组；Real．timePCR重庆医科大学博士研

5、究生学位论文法检测CCSPmRNA的表达量：Western．blot法检测CCSP蛋白含量；流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度。结果：经过MTT法筛选，PD的最适浓度为O．5mmol·L～，LPS的最适侬度为100mg·L～，各组CCSPmRNA表达情况为：PD+LPS组>PD对照组>正常对照组>LPS+PD组>LPS模型组。各组CCSP蛋白表达情况为：PD对照组>PD+LPS组>正常对照组>LPS+PD组>LPS模型组，各组Ca2+浓度如下：LPS模型组>LPS+PD组>PD+LPS组>正常对照组>PD对照组。结论：在内毒素诱导的BEAS．2B细胞中，PD可以促进CCSPmRNA和蛋白的表达

6、，降低胞内ca2+浓度，预防性应用的效果明显优于治疗组，因此通过体外实验研究进一步证明PD对内毒素性肺损伤的保护作用可能与其对CCSP和Ca2+浓度的调节有关。关键词：白藜芦醇苷，内毒素，肺损伤，CCSP，Ca第三部分：白藜芦醇苷作为一种PLA2抑制剂的体外筛选目的：探讨白藜芦醇苷(PD)是否是一种PLA2抑制剂。方法：以大豆磷脂酰胆碱为底物，通过分光光度法测定PLA2水解底物产生游离脂肪酸的量，间接反映待测物对PLA2活性的影响，并考查酶浓度、底物浓度及反应时间与游离脂肪酸生成量的线性关系。结果：白藜芦醇苷不能直接抑制PLA2的活性。结论：白藜芦醇苷不是磷脂酶A2抑制剂，其抑制PLA2的作

7、用是通过间接因素实现。重庆医科大学博士研究生学位论文PoLYDATINSUPPRESSESLUNGINJURYFoLLOWINGENDOTOXICSHoCKVIADoWN．REGULATIoNOFPHoSoPHOLIPASEA2ACTIVITYABSTRACTPARrlloNE：POLYDATINUP．REGULATETHEEXPRESSIoNoFCLARACELLSECRETORYPRoTEINToSUPP