巨噬细胞在混合嵌合体诱导异种免疫耐受中作用实验探究

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1、巨噬细胞在混合嵌合体诱导异种免疫耐受中作用实验探究［摘要］目的研究巨噬细胞在建立非协调性异种混合嵌合体中的作用及混合嵌合体的形成对受体的免疫功能影响，探讨异种免疫耐受的机制。方法将非清髓性的预处理SD大鼠（受体）30只随机分成3组，A组（仅输注豚鼠BMC）；B组（豚鼠BMC移植组+空脂质体移植组）；C组（豚鼠BMC移植组+包裹clodronate脂质体移植组）。观察指标:大鼠肝脾CD68、嵌合体嵌合率、大鼠外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T检测、单向混合淋巴细胞反应。结果注射包裹clodronate脂

2、质体后24h受体大鼠肝脾（红髓及边缘带）中巨噬细胞消失，21d后与正常对照相比无差异。BMC移植后24h内各时间点，C组大鼠外周血中豚鼠细胞比例均高于A、B组；24h时大鼠脾、骨髓中豚鼠细胞比例，C组亦明显高于A、B两组；比较21d及35d嵌合水平，C组明显高于A、B两组。21d时CD3+、CD4+和CD8+T细胞比例均下降，各组CD4/CD8比值与对照组相比无差异。MLR显示耐受大鼠的免疫应答反应性降低，C组较其他组比最低。结论增加了供体BMC在受体体内的存活，从而提高嵌合水平，获得了更高水平的免疫抑制。［关键词

3、］巨噬细胞；嵌合体；免疫耐受；骨髓移植［中图分类号］R392.4［文献标识码］A［文章编号］2095-0616(2013)18-22-05目前，由于同种器官匮乏，器官移植的数量受到限制，异种移植是器官移植目前的重要研究方向之一。迟发性异种排斥反应(DXR)成为了异种器官移植的主要障碍［1-2］o研究表明T细胞在迟发性异种排斥反应(DXR)中起重要作用，特别是CD4+T细胞介导异种细胞排斥反应尤为重要［3-4］o诱导免疫耐受是抑制细胞免疫反应的最理想方法。而混合性嵌合是目前比较有前景的诱导异种免疫耐受的策略之一［5］

4、。在同种移植和协调性异种移植领域，利用混合嵌合体可诱导出供者特异性的免疫耐受［6］。但在非协调性异种移植供受体间，利用相同的方法却不能获得免疫耐受，其中原因之一就是供者骨髓细胞在受体体内迅速消失而不能形成持续稳定的嵌合体。有研究发现在比较猪-SCID/N0D小鼠(巨噬细胞功能缺陷)及猪-SCID小鼠嵌合体模型发现，前者的嵌合状态维持明显长于后者［7］。本研究在豚鼠到大鼠实验动物模型中，利用脂质体包裹clodronate清除受体巨噬细胞后，采用非清髓性的预处理方案诱导建立混合嵌合体，研究巨噬细胞在建立非协调性异种混合

5、嵌合体中的作用。1材料与方法1.1实验动物及分组供体选用健康三色豚鼠，雌雄不限，受体选用健康SD雌性大鼠，体重250〜300g,实验动物均由苏州大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK（苏）2002-0037o取7d前开始饮红霉素（250mg/L）和庆大霉素（320mg/L）水清洁级雌性SD大鼠，（D-0）接受60Coy射线（剂量率0.5Gy/min,总剂量5.OGy）全身照射，照射后4h内经后肢隐静脉输注2X108/mL豚鼠BMC的细胞悬液0.8mL（24h实验组大鼠输注经CFSE标记的豚鼠BMC细胞悬液

6、），2d（D-2）后经环磷酰胺预处理（腹腔内注射CTX,50mg/kg）,实验动物随机分为3组，每组10例（各组5例预处理后24h处死）:A组（豚鼠BMC移植组）：仅行豚鼠BMC移植；B组（豚鼠BMC移植组+空脂质体移植组）：BMC移植前3d经后肢隐静脉输注不含clodronate空脂质体（每天2次，每次ImL）,余同A组；C组（豚鼠BMC移植组+包裹clodronate脂质体移植组）:BMC移植前3d经后肢隐静脉输注含clodronate脂质体共120mg/kg（每天2次），余同A组。1.2豚鼠骨髓细胞制备将豚鼠

7、颈椎脱臼处死后，置于75%酒精中浸泡15min,无菌条件下取股、胫骨，用RPMI1640冲洗骨髓腔，反复吹打，分散细胞，200目钢筛过滤制成单细胞悬液，加红细胞裂解液裂解红细胞后PBS液洗2次，以RPMI1640调整细胞浓度为2X108个/mL备用，台盼兰染色法判定细胞活率＞90%。1.3脂质体包裹Clodronate制备脂质体的制备采用反相蒸发技术，即70.9mg磷酸卵磷脂、10.8mg胆固醇溶于10mL氯仿溶液中，同时加入1.8mg/mLp-aminopheny1a-D-mannopyranoside甲醇溶液2

8、mL,形成月旨质，加入10mLclodronate(10mg/mL)PBS溶液，于56°C超声水浴lOmin,从而形成水包油乳剂，进而于56°C旋转蒸发,形成完整脂质体。空白脂质体即在形成脂质体后加入10mLPBS溶液，余同脂质体制作。制备好脂质体及空白脂质体置4£冰箱备用。1.4CFSE标记豚鼠骨髓细胞及体内追踪检查活体染料竣基荧光素乙酰乙酸(carbox