银杏内酯b对大鼠体外bmscs向神经样细胞的诱导分化作用研究

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1、徐州医学院硕士学位论文银杏内酯B对大鼠体外BMSCs向神经样细胞的诱导分化作用研究姓名：刘德全申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：刘永海2012-03徐州医学院硕士学位论文———————————————————————————————————————————————————一——-银杏内酯B对大鼠体外BMSCs向神经样细胞的诱导分化作用研究中文摘要目的通过检测银杏内酯B诱导后神经样细胞的功能及分化程度，研究银．爵内酯B对SD大鼠BMSCs向神经样细胞的诱导分化作用，从而为药物诱导后干细胞的体内移植提供实验支

2、持。方法将四周龄SD大鼠(雌雄不限)，无菌条件下分离股骨和胫骨，利用密度梯度离心法和贴壁培养法分离纯化BMSCs。取第三代BMSCs，流式细胞仪俭测后，选取分布均一的细胞，随即分为3组，PBS组、FGF组、GB组，又依据不同浓度GB组分为四个亚组GBI(20n1∥L)；GB2(40mg／L)：GB3(60rag／L)；GB4(80mg／L)，分别对BMSCs进行诱导分化：倒置显微镜下于24h、48h、72h后观察各组细胞形态，应用膜片钳技术，采用全细胞记录方式，检测GB处理组和PBS组细胞的电生理；采用免疫荧光方

3、法分别检测乙酰胆碱合成酶、胶质原纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶染色阳性细胞的表达情况。结果BMSCs鉴定：1、形态学观察：对获耿细胞经过梯度密度离心法结合连续换液培养传至第三代，细胞逐渐纯化，形态均一，贴壁好，形态学观察到细胞扁平呈梭型，集落细胞排列有一定方向性，呈辐射状、旋涡状排列。2、流式细胞学鉴定：对第三代细胞进行流式细胞计数显示CD90、CD29、阳性细胞数在90％左右，CD34、CD45阳性细胞小于1％。3、分化能力：经GB、FGF诱导的BMSCs细胞在形态学和免疫荧光、神经电生理检测证实其有向神经

4、样细胞的转化能力。诱导后细胞的鉴定：l、形态学观察：倒置显微镜下观察经GB诱导24h后少量细胞形态发生改变，细胞形态不规则，细胞突起逐渐增多，突起相互连接形成’徐州医学院硕士学位论文网状，胞体收缩变圆，并出现突起，立体感、折旋光性增强，并可见细胞问形成的网络结构，48h诱导的细胞形态更加明显，细胞突起变长，折光性强，72小时诱导后的细胞可见胞核椭圆形或圆形，胞核周边可见明显光晕。诱导24h、48h、72h后的每百个细胞中神经样细胞数量统计显示，不同剂量银杏内酯B组较PBS组明显增多，差异有统计学意义(P(0．01

5、)，与PBS组比较，诱导组间差异无统计学意义(P>0．05)，银杏内酯B组各剂量组问比较无明显统计学差异(P>O．05)。2、经GB诱导后的的神经样细胞与未诱导的BMSCs的膜电位特性有显著的改变，得到的神经样细胞具有类似于神经元的电生理的改变。GB诱导后细胞与对照组诱导细胞的电流幅值存在较大差异。全细胞电压钳记录模式下，可记录到一系列内向电流，激活阈值在．30mV，峰值电压在0mV，未分化细胞的峰值电流为(1．474-0．15PA／PF，n=10)，GB诱导后的神经样细胞为(2．184-0．16PA／PF，n=

6、24)，差异有统计学意义(P<0．05)。3、免疫荧光染色显示经过GB及FGF诱导的细胞，神经特异性标志物GFAP、NSE、CHAT阳性表达的细胞数量较PBS组增加。免疫荧光染色阳性细胞数计数显示，各组细胞免疫荧光结果在GB组中GFAP、CHAT、NSE阳性细胞数较PBS组明显增多，差异有统计学意义(P(O．05)；GB各剂量组中阳性细胞数较FGF组差异无明显统计学意义(P>0．05)。GB组问比较无明显差异性(P>0．05)。结论1．经GB诱导的BMSCs，不仅具有神经样细胞的外形和免疫学特征，而且具有神经元相

7、类似的基本电生理功能和神经递质的合成功能。2．GB诱导的BMSCs可以同时表达向多种神经样细胞分化方向神经标志物，且其阳性率均较高，表明短期诱导的BMSCs细胞具有了定向向神经样细胞分化的干细胞特征。3．银杏内酯B可诱导BMSCs向神经样细胞分化。关键词：银杏内酯B；BMSCs；转分化；膜片钳；免疫荧光染色徐州医学院硕士学位论文TheinductionofGinkgolideBinSDrats’bonemarrowmesencaymestemcellsintoneuron-liRecellsinvitrolll●

8、l●ll’●‘·AbstractObjectiveToinvestigatetheinductionoftheGinkgolideBtoSpragueDawleyrats’bonemarrowmesenchymestemcellsintoneuron，weutilizedlaboratorytechniquetodetect*henero,’e—likecell?Sfun