山羊c-myc基因的原核表达及多克隆抗体和单克隆抗体的制备

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1、广西大学硕士学位论文山羊c--Myc基因的原核表达及多克隆抗体和单克隆抗体的制备姓名：张昀申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：郑喜邦20120628山羊c-Myc基因的原核表达及多克隆抗体和单克隆抗体的制备摘要c—Myc是一种重要的原癌基因，它可以作为一种转录因子，在维持胚胎干细胞的生物学特性和诱导多性干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPS)形成的过程中发挥重要的作用。因此制备其相应的多克隆抗体和单克隆抗体非常必要，这将为进一步研究山羊ES细胞和iPS细胞的自我更新机制奠定基础。试验1．以pMDl8T-Myc质粒为模版，P

2、CR扩增c．Myc片段，然后将其亚克隆到pSE380表达载体上，获得pSE380．Myc重组质粒。该质粒转化工程茵BL21(DE3)，IPTG诱导表达His．Myc融合蛋白，随后用SDS．PAGE电泳及Westernblot加以验证。在变性条件下用Ni．NTAargrose介质分离纯化His．Myc融合蛋白，并以此为抗原皮下注射新西兰大白兔，间隔2．3周注射1次，共4次。最后一次免疫后7天，采血分离血清，用Westernblot检测抗体特异性。结果表明：(1)pSE380．Myc重组质粒在工程菌BL21(DE3)得到了高效表达；(2)得到了高纯度高含量的His．

3、Myc融合蛋白；获得的多克隆抗体与His．Myc融合蛋白能够特异性结合。结论：本试验成功获得了特异性山羊c．Myc多克隆抗体。试验2．利用上述纯化的His．Myc融合蛋白做为抗原，免疫7-9周龄的雌性BALB／C小鼠，经过四次免疫后取小鼠脾脏细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合。采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，应用有限稀释法对其进行3．4次亚克隆，获得稳定分泌抗C．Myc蛋白抗体的杂交瘤细胞株，并将其腹腔注射BALB／C小鼠。7—1O天后采集腹水，间接ELISA测定腹水抗体效价，以单克隆抗体亚类鉴定试剂盒测定抗体亚类。结果表明：(1)获得了稳定分泌抗C

4、．Myc蛋白抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1F10、2H10和3810，培养液上清抗体效价分别为1：10000、1：8000、1：6000。(2)1F10、2H10两株杂交瘤细胞在小鼠体内诱生的腹水抗体效价分别为1：1280000和1：640000，抗体亚类均属于IgG1类。(3)核型分析表明，杂交瘤细胞的染色体众数为90—100。(4)间接ELISA显示，上述3杂交瘤细胞株体外传代和冻存复苏后的培养液上清OD值基本保持不变，抗体分泌稳定，证明山羊c。Myc单克隆抗体制备取得满意结果。关键词：山羊c_Myc基因多克隆抗体分子克隆原核表达蛋白纯化单克隆抗体Prok

5、aryoticExpressionofc—MycGeneandPreparationofPolyclonalAnti-—C·-MycAntibodyandMonoclonalAnti—-C--MycAntibodyinCapraHircusABSTRACTc—Mycisaimportantprotoncogene．Asakindoftranscriptionfactors，Itplaysanimportantroleinmaintainingbiologicalcharacteristicsofembryonicstemcells(EScells)andindu

6、cedpluripotentstemcells(iPScells)．Itisurgentlynecessarytoprepareitspolyclonalandmonoclonalanti·-C-·MycantibodyinCapraHircus，whichwillleadtofurtherstudyself-renewmechanismofEScellsandiPScellsinCapraHircus．1．TheplasmidpMD18T—Mycwasusedastempletetoamplifyc—Myc—fragment，whichwassubcloned

7、tovectorpSE380toconstructrecombinantplasmidpSE380一Myc．TheplasmidwasthentransformedintoEcoli．BL21(DE3)，andHis-Mycfusionproteinwasexpressed而minductionofIPTG，whichWassubsequentlyverifiedbySDS—PAGEandWesternblotassay．PurifiedwithNi-NTAargroseunderdenaturingconditon，His．Mycfusionproteinwa

8、susedasantig