cxcr4-sirna重组腺病毒载体的构建及其沉默cxcr4基因的体外研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文CXCR4--siRNA重组腺病毒载体的构建及其沉默CXCR4基因的体外研究姓名：刘瑜申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：袁瑞201205CXCR41iRNA重组腺病毒载体的构建及其沉默CxCR4基因的体外研究摘要第一部分应用AdMmx载体系统构建CXCR4-siRNA重组腺病毒载体目的：应用AdMax载体系统构建CXCR4．siRNA重组腺病毒载体，为研究其对人卵巢癌细胞株SKOV3的CXCR4基因表达的影响奠定基础。方法：将CXCR4基因的小干扰片段克隆至腺病毒穿梭质粒PAVsil．1，通过PCR和测序筛选阳性克隆，将重组穿梭质粒、

2、腺病毒辅助包装质粒、3Cre共转染HEK293细胞，包装产生CXCR4-siRNA重组腺病毒载体。在HEK293细胞中大量包装扩增病毒，收集病毒液，测定病毒滴度。结果：PCR和测序结果均提示CXCR4基因的小干扰片段成功构建至腺病毒穿梭质粒，通过HEK293反复包装扩增后，在荧光显微镜下可观察到HEK293细胞中绿色荧光蛋白的大量表达，病毒滴度为6×108PFU／ml。结论：AdMax载体系统可成功构建CXCR4一siRNA重组腺病毒载体。关键词：RNA干扰；重组腺病毒载体；转染；HEK293细胞第二部分CXCR4-si刚A重组腺病毒载体沉默人卵巢癌细胞株CxCR4

3、基因表达的研究目的：研究CXCR4．siRNA重组腺病毒载体对人卵巢癌细胞株SKOV3的CXCR4基因表达的影响。方法：将收集的大量病毒液转染人卵巢癌细胞株SKOV3。细胞分为三组：siRNA组，转染空病毒载体的阴性对照组，细胞不做任何处理的空白对照组。通过PCR、Westernblot、免疫组化检测CXCR4基因沉默效果。结果：病毒转染至SKOV3细胞后，在荧光显微镜下可观察到SKOV3细胞中绿色荧光蛋白的大量表达，重组腺病毒能够有效抑制SKOV3细胞中CXCR4的表达。结论：CXCR4一siRNA重组腺病毒载体可高效转染靶细胞和沉默CXCR4基因的表达，为RNA

4、干扰技术应用于卵巢癌的临床基因治疗奠定基础。关键词：CXCR4基因；重组腺病毒载体；卵巢癌重庆医科大学硕士研究生学位论文STUDYoNTHEEXPRESSIONOFCXCR4GENESILENCEDBYCXCR4．SIRNARECoMBINANTADENOVIRALINHUMANOVARIANCANCERCELLSABSTRACTPARTONECONSTRUCTIONOFCXCR4．SIRNARECOMBINANTADENOVIRALVECToRBYADⅣ认XSYSTEMObjective：Toconstructrecombinantadenoviralvector

5、carryingshortinterferingRNA(siRNA)byAdMaxvectorsysteminordertostudytheexpressionofCXCR4geneinSKOV3cells．Methods：TheshortinterferingRNA(siRNA)ofCXCR4genewasclonedintotheshuttleplasmidPAVsil．1．ThePCRandsequenceanalysiswereusedtodetectinterferingfragment．Thepositiverecombinantshuttleplasm

6、id，adenovirushelperplasmidpBHGlox(delta)E1and3CreweretransfectedintoHEK293cellstoconstructCXCR4一siRNArecombinantadenoviralvector．CXCR4．siRNArecombinantadenoviralvectorwasrepeatedlypackagedandamplifiedinHEK293cellsandvirustiterwasdeterminedResults：PCRanalysisandsequencingconfirmedthatth

7、eshort5interferingRNA(siRNA)wassuccessfullyinsertedintotheadenovirusvector,．AfterthepackageandamplificationofHEK293cells，thegreenfluorescentproteinexpressedhighlyinHEK293cellsunderfluorescentmicroscope．Theviraltiterswere6×108PFU／m1．Condusion：TheCXCR4．siRNArecombinantadenoviralvectorc