携带kgf基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

《携带kgf基因重组腺病毒载体的构建与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、携带KGF基因重组腺病毒载体的构建与鉴定贾庆华哈小琴﹡吕同德刘春杰（中国人民解放军兰州军区兰州总医院医学实验中心，甘肃省干细胞与基因药物重点实验室，甘肃兰州730050；﹡通讯作者）摘要目的构建携带KGF基因的腺病毒载体（Ad-KGF）并观察其在细胞中的表达。方法通过PCR从pIRES2-EGFP-KGF质粒中扩增出目的片段KGF，定向克隆至穿梭质粒载体pShuttle-CMV中，构建pShuttle-KGF。经酶切及测序鉴定后，再将KGF定向克隆至重组腺病毒骨架载体pAdxsi，构建携带KGF基因表达盒以及GFP的重组腺病

2、毒载体（pAdxsi-GFP-KGF）。酶切鉴定正确后，转染人胚肾细胞系HEK293细胞，进行重组腺病毒的包装、生产及纯化，半数组织感染量法（50%tissuecultureinfectivedose，TCID50)测定重组腺病毒滴度。用重组腺病毒及空病毒Ad-null(作为阴性对照)转染人肺腺癌细胞A549，荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白的表达，ELISA鉴定KGF的表达。结果成功构建了携带KGF的重组腺病毒（Ad-KGF），纯化后病毒滴度达1.6×1010pfu/ml。Ad-KGF转染A549细胞后24h在荧光显微镜下

3、即可观察到绿色荧光蛋白，48h表达更强，ELISA实验证实细胞表达KGF。结论成功构建了携带KGF的重组腺病毒（Ad-KGF），为下一步研究KGF用于肺纤维化治疗研究奠定了实验基础。关键词：KGF（keratinocytegrowthfactor,KGF）；腺病毒；构建；表达ConstructionandidentificationofrecombinantadenovirusvectorofkerationcytegrowthfactorJIAQing-huaHAXiao-qinLVTong-deLIUChun-jieEx

4、perimentalCenterofMedicine,LanzhouGeneralHospitalofLanzhouMilitaryAreaCommandofChinesePLA,KeyLabaratoryofStemCellandGeneDruginGansuProvince,Lanzhou730050,GansuProvince,ChinaAbstractObjectiveToconstructandidentifiedarecombinantadenovirusvectorexpressingkeratinocyteg

5、rowthfactor(KGF)gene.MethodsKGFgeneamplifiedfromtheplasmidpIRES2-EGFP-KGFbypolymerasechainreaction(PCR)andtheninsertedintotheplasmidpShuttule-CMVtoconstructpShuttle-KGF.AfterconfirmedbyrestrictionenzymedigestionandDNAsequencing,theDNAencodingKGFinthenewconstructwas

6、insertedintothevectorofrecombineplasmidadenovirusandconfirmedbyrestrictionenzymedigestion.Thenthehumanembryonickidneycellline293wastransfectedwithcorrectlyidentifiedpAdxsi-KGFandtherecombinantadenoviruswereamplifiedandpurified,thevirustiterwasdetectedusing50%tissue

7、cultureinfectivedose(TCID50)assay.TheexpressionofthegreenfluorescenceproteinandKGFweredetectedbyfluorescentmicroscopeandELISAaftertherecombinantadenovirustransfectinghumanlungcancerA549cellline.ResultsTherecombinantadenoviruspAdxsi-KGFwasconstructedandamplifiedwith

8、titerof1.6×1010pfu/ml;thegreenfluorescenceproteinscanbeobservedunderfluorescentmicroscopeinA54924houraftertransfectionwithastrongerdegreeafter48h