dab2ip在结直肠癌侵袭和转移中的作用机制

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1、南方医科大学2011级博士学位论文DAB2IP在结直肠癌侵袭和转移中的作用机制ThefunctionandmolecularmechanismsofDAB0lecUlarmecIian2IPin么lt，Ininvasionandmetastasisofcolorectalcancer课题来源：广东省高校学科与专业建设专项基金学位申请人王舰梅导师姓名丁彦青梁莉专业名称病理学与病理生理学培养类型学术型培养层次博士研究生所在学院基础医学院2014年5月17日广州博士学位论文jIIJIJllJllJJIIIIIIIJIIIIIIIIIJJJJIIJY2618408DAB2IP在

2、结直肠癌侵袭和转移中的作用机制博士研究生：王舰梅指导教师：丁彦青教授梁莉教授研究背景和研究目的摘要结直肠癌是全世界常见的恶性肿瘤之一。在中国，结直肠癌的发病率位居恶性肿瘤第五位，其发病率呈逐年上升的趋势。转移是结直肠癌复发和死亡的主要原因，而临床上很多结直肠癌患者在接受手术之前已经发生了微转移。因此，找到有效预防和治疗结直肠癌转移的新方法是当今肿瘤学研究的一项迫切任务。人DOC．2／DAB2相互作用蛋白基因(DAB2IP)，又称为ASKl相互作用蛋白(MPl)，是最近发现的RasGAP家族的一个新成员，它位于9q33．1_q33．3染色体。DAB2IP直接与DAB2(也

3、被称为DOC．2)的N端区域相互作用，形成一个独特的蛋白复合体，并对Ras介导的信号通路起负向调控作用。近来研究表明，DAB2IP在人类多种癌组织中表达下调，并受表观遗传学调控如DNA甲基化和／或组蛋白修饰。此外，DAB2IP参与调控肿瘤生长和转移过程。DAB2IP通过Ras．GAP活性，抑制Ras调节的细胞信号通路，导致细胞生长受到抑制。DAB2IP通过精确调节Ras和NF．Kb信号通路，抑制前列腺癌的生长和转移。DAB2IP还可诱导前列腺癌中MET的发生，该机制是通过募集PP2A与GSK．3p相互结合，从而降解胞浆内摘要13-catenin而实现的。DAB2IP通过

4、VEGFR．3调节肿瘤血管和淋巴管生成。本课题组研究还发现DAB2IP表达下调与肝癌的演进和预后不良密切相关。目前有关DAB2IP在结直肠癌侵袭和转移中的转录调控及作用机制尚不清楚。本研究将揭示结直肠癌中DAB2IP基因的转录调控及组蛋白修饰新机制，探讨Snail／DAB2IP正反馈通路对结直肠癌增殖、EMT、侵袭及转移的影响，检测Snail／DAB2IP正反馈轴在结直肠癌组织中的表达及预后价值；旨在阐明DAB2IP在结直肠癌侵袭和转移中的作用机制，为结直肠癌转移的早期预警、预后评估提供潜在应用靶点。研究方法1．DAB2IP沉默对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响1)利

5、用Real．TimePCR和Westernblot检测8种结直肠癌细胞株DAB2IP的表达。2)DAB2IP的CDS区3399bp，上下游GC含量差异较大，多次构建DAB2IP过表达载体均失败。采用慢病毒感染的方法构建稳定干扰DAB2IP细胞株(SW480／SiDAB2IP．1／．2、HCTll6／SiDAB2IP．1／．2)和对照细胞株(SW480／NC、HCTl16／NC)，并使用Real．TimePCR和Westernblot鉴定其干扰效率。3)采用MTT、平板克隆形成实验、流式检测周期、凋亡实验检测干扰DAB2IP后对细胞增殖能力、克隆形成能力、周期和凋亡的影响

6、；采用细胞粘附实验检测干扰DAB2IP后对细胞粘附能力的影响；采用小室迁移实验，小室侵袭实验、Westernblot和免疫荧光实验检测干扰DAB2IP后对细胞的迁移、侵袭能力及EMT相关分子的影响。采用细胞球形成实验、Westemblot检测干扰DAB2IP后对细胞的干性的影响。4)采用裸鼠皮下成瘤实验、肿瘤细胞尾静脉注射实验观察干扰DAB2IP后对结直肠癌细胞在裸鼠体内成瘤能力、侵袭及转移能力的影响。2．Snail负向转录调控DAB2IPII博士学位论文1)利用软件预测转录因子Snail在DAB2IP启动子潜在结合位点。2)利用双荧光素酶报告系统和CHIP实验检测Sn

7、ail的确切结合部位及对DAB2IP转录活性影响。3)利用Westernblot检测干扰和过表达Snail对DAB2IP蛋白表达的影响。3．EZH2．HDACl／HDAC2．Snail线性复合物对DAB2IP的表达调控1)构建EZH2基因过表达载体和EZH2基因set区域缺失载体EZH2／kset，利用Westernblot实验筛选EZH2干扰片段2)利用Westernblot检测过表达EZH2和干扰EZH2检测DAB2IP的表达。31利用Westernblot检测EZH2、EZH2／kset、乙酰化酶抑制剂TSA处理后EZH2、H3、H