甲型h1n1猪流感病毒单克隆抗体的制备及夹心elisa检测方法的建立

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1、MasterThesisDevelopmentofMonoclonalAntibodiesagainstH1N1InfluenzaVirusofPigOriginandDoubleAmibodiesSandwichELISAforH1N1InfluenzaVirusDetectioncandidate：YannaTianAdviser：Prof．SongGaoMajor：PreventiveVeterinaryMedicineYangzhouUniversityMay，2012艳娜：甲型H1NI猪流感病毒单克降抗体的制备及双抗体夹

2、心ELISA检测方法的建移甲型H1N1猪流感病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立嘲摘要猪流感(swineinfluence，SI)是由猪流感病毒引起猪的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病，猪流感病毒主要包括H1N1，H1N2，H3N2等亚型A型流感病毒。猪作为人流感和禽流感病毒的中问宿主，被称为流感发生基因重排的“混合器”。猪流感的流行对感染猪群造成巨大的经济损失，并具有重要的公共卫生意义。本研究于2011年在江苏省扬州市某屠宰场采集猪鼻拭子433份和肺组织及肺门淋巴结各343份。共分离到6株猪流感病毒。对

3、分离到的6株猪流感病毒进行HA及RT-PCR方法检测结果均为病毒阳性。同时本研究用广东2009年流行分离株甲型H1N1流感病毒作为免疫原，免疫6～8周龄BALB／C小鼠，取其脾与SP2／0细胞融合。细胞融合后同时用ELISA、IFA及HI三种方法检测筛选，经过多次克隆得到8株杂交瘤细胞，分别为：2811、184、2C7、3A4、6A9、682、388、6D11。其中，2811及6D11针对的是血凝素蛋白(HA)，184、2C7及6A9针对的是神经氨酸酶(NA)，3A4、682、388针对的是基质蛋白(M1)。8株单抗与分离的H1N

4、1病毒均能产生不同类型的反应，而2811，184，2C7，6A9，6D11与H5、H9亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)、新城疫病毒(Newcastledisease，NDV)等病毒均不发生反应。用间接免疫荧光方法检测3A4，682，388与所有A型流感病毒均反应，与NDV不反应，荧光主要在细胞的胞浆内，而184、2811、2C7、6A9、6D11的荧光主要在细胞膜周围。根据把株单抗的特性，我们挑选出3A4及184两株单抗建立了检测H1N1病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法。首先将单抗腹水用辛酸．硫酸

5、铵沉淀法及亲和层析法进行纯化，根据两两配对筛选，最终选择以184作为捕捉抗体，3A4作为检测抗体。然后将3A4抗体用辣根过氧化物酶(HI冲)标记。经过包被、封闭、二抗作用时间等条件的优化与筛选，最终建立了特异性好、灵敏度高的夹心ELISA方法，该检测方法与H5、H9亚型AIV、NDV等病毒均无交叉反应。用该方法检测了猪鼻棉拭50份及肺与肺门淋巴结组织样品各20份，表明以该方法检测结果与HI试验检测结果相符率为97．8％。我们建立的夹心ELISA扬州1人学硕tj学位论文为H1N1亚型猪流感的监测与诊断提供了一种更简单、快速、灵敏的检

6、测方法。关键词：H1N1亚型猪流感；单克隆抗体；双抗体夹心ELISA2}H艳娜：fTi型H1N1猪流感病毒甲境隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立DevelopmentofMonoclonalAntibodiesagainstH1N1InfluenzaVirusofPigOriginandDoubleAntibodiesSandwichELISAforHlN1InfluenzaVirusDetectionAbstractSwineinfluenza(SI)isahighlycontagiousrespiratorydi

7、seasecausedbyswineinfluenzavirus(SIV)，includingH1N1，H1N2，H3N2sutypesofSIV．Swinesarethehostofbothavianoriginandhumanorigininfluenzaviruses，andCanactasananimalreservoirwhereinfluenzavirusgenesbecomeantigenicallyfrozenforlongperiodsoftime，facilitatingthegenerationofhuman

8、pandemicviruses．ThepandemicofSIVmaycauseeconomiclosses，anditisveryimportanttopublichealthsignificance．Fourhundredandthirty-t