甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立.pdf

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1、动物医学进展。2011，32(8)：37-41ProgressinVeterinaryMedicine甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立王云龙，周春峰，孙新城，李玉林。，陈冬焕。，李恒思。，昌静峰。，王国强。，董彩文。“，刘旺根。“(1．河南工业大学，河南郑州450001；2．郑州职业技术学院，河南郑州450121；3．河南省生物工程技术研究中心，河南郑州450001；4．郑州大学河南郑州450001)摘要：建立甲型HIN1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法，通过优化IPTG浓度和诱导时间确定HA融合蛋白的最佳表达条件，并进行

2、Westernbloc和血凝试验鉴定。用纯化蛋白制备单克隆抗体，建立检测甲型HlN1流感病毒的双抗体夹心ELISA检测方法，对其交叉反应、符合率进行验证。结果表明，HA蛋白在BL21(DE3)中得到表达，主要以包涵体的形式存在，分子质量为64ku，最佳诱导条件为IPTG终浓度0．2mmol／L，诱导时间4h。Westernblot鉴定其与H1N1病毒有相同的抗原性，血凝试验表明无血凝活性。制备HA单抗并初步建立双抗体夹心ELISA检测方法，检测100份阳性PCR样本，符合率为96。建立的夹心ELISA方法可用于HINl亚型流感病毒的初步诊断。关键词：血

3、凝素；甲型H1N1流感病毒；原核表达；双抗体夹心ELISA中图分类号：$5852．659．5文献标识码：A文章编号：1007—5038(2011)08—0037-042009年新型三源重组甲型人流感病毒(HIN1)1．1．2病毒和血清甲型流感病毒H1、H5、H9亚在世界范围内广泛传播[1．n，给世界造成了严惩经型及肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)、麻疹病济负担。流感病毒属于正黏病毒科，病毒基因组含毒(morbillivirus，MV)灭活物由河南省生物工程中8个负链单股RNA，其中血凝素(HA)糖蛋白由片心提供，标准阳性样品(流感

4、病毒裂解疫苗段4编码，是病毒最重要的表面抗原，具有亚型特异2O1OO4AOO1)购自华兰生物制品有限公司；标准阴性，可以诱导特异性中和抗体的产生，对流感病毒及性样品、鼠抗HIN1流感病毒阳性血清由本实验室其亚型的诊断具有重要的价值。保存。甲型H1N1流感病毒的检测方法包括病毒分离1．1．3试剂酶标兔抗HA多抗由河南省生物工鉴定、PCR、基因芯片技术等[3]。病毒分离鉴定需程技术研究中心制备；甲型H1N1流感病毒RNA较长时间和严格的无菌操作，PCR技术需要昂贵的检测试剂盒购自北京金豪制药公司；蛋白Marker设备和受过特殊专业培训的人员。本研究通过表达

5、(SM0441)购自晶美公司；HisBindPurificationKitH1N1亚型流感病毒的HA基因，制备抗HA单克购自Novagen公司；山羊抗鼠IgG-HRP，RPMI-隆抗体，初步建立检测HINI亚型流感病毒的夹心1640、HT、HAT、DAB、IPTG购自Sigma公司；ELISA方法。PEG2000购自Merck公司；其他化学试剂均为国产1材料与方法．分析纯。1．1材料1．1．4实验动物Balb／c纯系小鼠购自中国医学1．1．1菌种和质粒含有H1N1亚型HA蛋白基科学研究院动物研究所。因原核表达质粒(pET-30Xa／LIC～HA)，由河

6、南省1．2方法生物工程技术研究中心构建并保存，E．coliBL211．2．1最佳诱导条件的确定挑单个BL21(DE3)(DE。)由本实验室保存。菌落接种于3．5mLLB培养基(含50g／mL卡那收稿日期：2010—12—15基金项目：郑州市重大科技专项(093SGBS22027)；2010河南省工程技术中心专项经费(1O2lO23l3l05)作者简介：王云龙(1962一)，男，河南洛阳人，教授，主要从事生物制药研究。*通讯作者38动物医学进展2011年第32卷第8期(总第218期)霉素)中37℃振荡培养，OD6‰至0．6～O．8时分别H1N1流感病毒R

7、NA检测试剂盒测定的阴性咽拭加IPTG终浓度至o．05、o．1、o．2、o．3、o．4、o．5、o．子样本，双波长测定OD值，每份样品设立两个重6、0．7mmol／L，于37℃下诱导表达5h，取不同时孔。计算出12份样品的平均OD值和标准方差间段(诱导表达0、2、3、4、5、6、7、8h)的菌液各1mL(SD)。根据统计学原则，样本的OD值>阴性样本煮沸裂解，离心后加水和上样缓冲液进行SDS-OD均值(X)+3×SD时，判为阳性，OD值<阴性样PAGE电泳。本OD均值(X)+2XSD时为阴性，两者之间为可1．2．2表达产物的纯化最佳条件下大样诱导并疑，

8、需重复检测一次，OD值>OD均值(X)+3XSD对产物进行SDS-PAGE电泳，进行可溶性分析