猪瘟强毒株与兔化弱毒疫苗株的环介导等温扩增鉴别检测

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1、Athesis(dissertation)submittedtoZheng吐ouUniVers埘forthede酽eeofMasterTheDifrerentiationandDetectionofVilmlemand、厂accineStraillsofClassicalSwilleFeVerV．眦sbyLoop-mediatedIsomemalAmplificationAssayByW．enboHeSuperVisor：Pro￡GaipingZhangM旬or：CellBi0109ySchool

2、ofLifeSciencesApril2014学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：／(司之博日期：列忏多月／日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留

3、或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库迸行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：／f可吏博日期：砷中年／月／日摘要猪瘟(claSsicalswhefever，CSF)是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒(claSsicalswiIle是vervir

4、us，CSFV)引起的一种重大传染病，具有很高的死亡率，对我国生猪产业造成巨大的损害。CSFV是单股正链I矾A病毒，基因组大小约为12．3kb，编码一个大的多聚体蛋白，蛋白酶将其裂解成12种蛋白，包括8种非结构蛋白(尸7、坳，D、Ⅳ蛇、Ⅳ站、删、脚、删、脚)和4种结构蛋白(囊膜糖蛋白D凇、衣壳蛋白C、EJ、脚)，其中，5，．∽哝、3，-∽哝、脚基因序列比较保守，而Ⅳ鼯B常用于CSFV基因分型。目前，我国猪瘟的防控主要采用猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)免疫，但是由于缺乏相应的血清学标志和配套的鉴别检测

5、方法，其在我国的大规模应用，使得通过抗体检测很难区分免疫弱毒和野毒感染，不利于猪瘟的净化。针对猪瘟病毒野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断的关键问题，本研究参照GellBaIlk中登录的CSFV标准强毒株(shjmen、A1fort、Brescia等)、疫苗株(HCLv、ChiIleseC、础mes等)、不同基因亚型的CSFV野毒株以及牛病毒性腹泻病毒1型(BVDv-1)和牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)的全基因组序列，利用DNAstar软件系统比较分析猪瘟强弱毒株的序列差异，设计一套分别针对猪瘟弱毒与

6、强毒的特异性环介导等温扩增(LAMP)引物，优化I，AⅧ反应体系与反应条件，分别建立CSFV强毒株和弱毒疫苗株的L削诳，检测方法。结果表明65℃恒温作用50mill即可完成L√6山口扩增，LAMP扩增产物用罗丹明B指示剂肉眼观察颜色变化，阳性呈黄色，阴性呈橙红色；用琼脂糖凝胶电泳进行检测，阳性扩增有特异性梯形条带产生。经检测，猪瘟强毒株的特异性L舢心检测方法对猪瘟弱毒疫苗及其他猪源病毒均无特异性扩增，猪瘟弱毒疫苗株的L触v口检测方法亦如此，特异性良好，同时建立的L触心检测方法比RT-PCR灵敏度高

7、出1000倍，且重复性稳定性良好。用建立的LAMp方法和ImPCR方法检测20份猪病料，符合率为90．91％。因此，本实验建立的猪瘟强毒株与弱毒疫苗株的L肼P检测技术是一种快速准确，特异性好，灵敏度高，适合基层使用的方法，真正实现了对病原微生物核酸的特异、敏感、高效和快捷检测，为我国猪瘟防控与净化提供技术支撑，对动物疫病多重感染的鉴别检测具有重要意义。关键词：猪瘟强毒株；猪瘟兔化弱毒疫苗株；环介导等温扩增；鉴别检测Abs仃actAbStraCtClaSsicalswille受Ver(CSF)isa

8、地烈yinfectiousdiseaSea髋ct迹gsw逾eandboar，resul血19inseriouseconomic10sses，charaCterizedbyfeVer，hemo玎hage，arldhighmonali妙rates．CSFiscauSedbytllecl弱sicalswiIlefevervims(CSFV)．CSFVisamenlberoft11egenusPPsffvf，．搬，belongingtothe触ily月口vfl，f，．矗z口P．CSFVis