猪瘟强毒和疫苗株的环介导等温扩增检测方法

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1、猪瘟强毒和疫苗株的环介导等温扩增检测方法　　0、引言　　猪瘟(classicalsediatedisothermalamplification，LAMP)是一种新型核酸扩增技术，选用4～6条特殊引物(内向引物FIP/BIP、外向引物F3/B3和环引物LF/LB)识别靶序列6～8个特异性区域，具有极高的特异性;然后利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶，60～65℃恒温催化新链合成，从而使靶基因达到高效扩增的目的，30～60min即可获得109靶序列拷贝．LAMP扩增产物为一系列序列反向重复的茎环结构和多环花椰菜

2、样结构构成的DNA片段混合物，并产生焦磷酸镁沉淀，因此可通过观察白色沉淀、荧光染料颜色变化、凝胶电泳或斑点杂交等判定结果．因此，LAMP反应特异性强、灵敏度高、快速准确、操作简单，同时对生物污染物的耐受性强，可有效克服PCR反应中常见酶失活的问题，在病毒、细菌、寄生虫等病原微生物的临床检测中得到广泛应用．在CSFV的LAMP检测方面，根据猪瘟病毒5'-UTR、E2或NS5B基因保守序列设计LAMP引物，建立了检测CSFV或HCLV的LAMP检测方法，其敏感性比RT-PCR高10～100倍，与荧光定量PC

3、R相当，但鉴别检测CSFV强毒和疫苗株RT-LAMP的报道还很少．因此，本文在分析CSFV全基因组序列的基础上，设计CSFV强毒和疫苗株的特异性LAMP引物，分别建立了CSFV强毒和疫苗株的LAMP检测方法，为我国猪瘟防控与净化提供技术支撑，对动物疫病感染的鉴别检测有重要意义．　　1、材料与方法　　1．1毒株　　CSFV标准强毒株(shimen)由河南省农业科学院动物免疫学实验室提供，猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)购自哈尔滨维科生物公司，以及实验室保存的PRV、PCV2、PRRSV、JEV等毒株．　　1．2主要

4、试剂　　BstDNA聚合酶(8U)，10thermopol反应缓冲液，dNTPmixture，DL2000DNAmarker，ExTaqDNA聚合酶，Mg2+/Mn2+混合物，TRIzol，异丙醇，无水乙醇，氯仿，琼脂糖，DEPC，罗丹明B衍生物荧光指示剂由河南省农业科学院王德国老师惠赠．　　1．3引物设计与合成　　参照GenBank中登录的CSFV标准强毒株(shimen、Alfort、Brescia、Glentorf等)，疫苗株(HCLV、ChineseC、Rimes等)、不同基因亚型的CSFV野毒株，BV

5、DV和BDV的全基因组序列，利用DNAstar软件进行比对，系统比较分析猪瘟强弱毒株的序列差异，确定鉴别检测的靶基因位于NS5B基因上，然后运用在线软件primerexplorerv4soften株300μL至灭过菌的1．5mL离心管中，用TRIzol试剂盒提取猪瘟病毒强毒株与兔化弱毒疫苗株的RNA，然后加13μLDEPC水溶解，用于RT-PCR反应．1．4．2RT-PCR依据GenBank中CSFVNS5B基因上的一段保守序列，利用primerpremier5．0软件设计PCR引物，进行PCR扩增

6、．先进行反转录，获得CSFVRNA后再进行PCR扩增，优化PCR循环参数，确定最佳扩增程序，然后用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定．　　1．5猪瘟强毒株与疫苗株的LAMP检测方法的建立　　LAMP反应体系为25μL:BstDNA聚合酶(8U)1．0μL，10Bstbuffer2．5μL，dNTP(10mmol/L)2．5μL，Mg2+/Mn2+混合物2μL，混合引物(F3、B3:5μmol/L;FIP、BIP:40μmol/L;LF、LB:20μmol/L;将稀释好的引

7、物等体积混合)共6．0μL，CSFV模板cDNA2．0μL，罗丹明B染料1μL，灭菌双蒸水8．0μL．在上述LAMP反应体系基础上设置不同的反应温度(61℃，63℃，65℃)，选择猪瘟强毒株与疫苗株的最佳作用温度;和不同的恒温作用时间(20min，30min，40min，50min，60min)，选择猪瘟强毒株与疫苗株最佳反应时间．　　1．6LAMP特异性检测　　用PRV，PCV2，PRRSV，JEV，CSFV的DNA或cDNA分别为模板，按照建立的LAMP反应体系和优化的反应条件进行扩

8、增，扩增结束后80℃加热2min，取5μL核酸产物做2%琼脂糖凝胶电泳，以鉴定LAMP扩增的特异性．　　1．7LAMP敏感性检测　　将提取的CSFV强毒株与疫苗株cDNA分别用灭菌双蒸水做10倍倍比稀释(101，102，103，104，105，106，107，108，109，1010)，然后分别做为模板，按照建立的LAMP反应体系和优化的反应温度和时间进行扩增，扩增结束后80℃加