海水养殖鱼类鳗弧菌分离株的血清型和基因型鉴定

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1、万方数据CharacterziationofSerotypeandgenotypeofVibrioanguillarumstrainsisolatedfrommarinefishThesissubmittedtoQingdaoAgo'culturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeOf—MasterofAgronomy1一一ZhaoLuning(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：P

2、rof．ZhangLecuiProf．MoZhaolanQingdao．ChinaJune．2014万方数据学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。学位论文作者签名：葱t掉签字日期．和脚6月撕学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国

3、家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文储繇趟查牢导师签字：签字日期：铷l耳年6月之6日1缘如缉签字日期：-刎{：年乡月以日万方数据青岛农业大学硕上学位论文摘要海水养殖鱼类鳗弧菌分离株的血清型和基因型鉴定摘要鳗弧菌(Vibrioanguillarum)属于革兰氏阴性茵，是海水养殖鱼类的主要病原菌，给水产业造成巨大的经济损失。鳗弧菌有23种血

4、清型，其中01、02、03为主要的致病菌。本研究将本实验室近10年分离和收集自海水养殖鱼类的鳗弧茵临床菌株进行生理生化和抗生素敏感性检测、血清学分型、基因分型，旨在了解我国海水鱼类养殖环境的鳗弧菌的血清型，分析血清型与基因型的关系，为进行鳗弧茵分子流行病学研究及疾病控制打下基础。主要研究内容如下：1．生理生化和16SrRNA基因分析：共有36株菌用于研究(包括3l株临床分离株和5株标准株)。用APIID32E鉴定系统分析菌株的生理生化特征，结果显示，所有菌株显示吲哚反应阳性，在赖氨酸脱羧酶、脲酶、L．阿拉伯糖醇、5．酮基葡萄

5、糖酸钠、侧金盏花醇、p．葡萄糖酸酶、N．乙酰．D葡萄糖苷酶、D．阿拉伯糖醇、肌醇的反应显示为阴性；多数菌株的精氨酸双水解酶(86．1％)、J3-葡萄糖苷酶(86．1％)和D．半乳糖苷酶(97．2呦的反应为阳性。鳗弧茵菌株既有稳定的生理生化性状，也有生理生化性状的多样性，但利用APl32E未能将待检菌株鉴定到种的地位。为此，将扩增得到的16SrRNA基因序列在GenBank上进行BLAST，结果显示有3l株菌与鳗弧菌相似性为99．100％，在系统进化树中聚为一类，具有最近亲缘关系。根据这个结果将31株待测菌株鉴定为鳗孤菌。2．

6、抗生素敏感性分析：利用ATB检测系统分析菌株的抗生素敏感性，结果显示，90％以上菌株对24种抗生素敏感；有80．6％(29株)菌的对9~16种的抗生素产生耐药，有25％(9株)的菌株对16种以上的抗生物产生耐药。其中，所有菌株对林可霉素、夫西地酸、甲硝唑、阿莫西林、阿莫西林／克拉维酸、苯唑西林、青霉素等7种抗生素耐药，94．4％(34株)的菌株对红霉素、原始霉素、泰洛星等3种抗生素耐药，86．1％(31株)菌株对磺胺甲恶唑耐药。3．血清学分型：制备了鳗弧菌01．05血清型兔抗血清，采用玻片凝集试验，对31株鳗弧菌临床菌株进行

7、血清型分型。结果如表显示，各血清型数量分别为：01血清型16株，02为5株，03为3株，05为1株，有6株菌株不属于01．05血清型。这个结果表明，我国海水养殖环境存在01—03血清型的鳗弧菌致病菌万方数据青岛农业大学硕-上学位论文摘要株，其中01为主要血清型。4．多位点序列分型(MLST)：PCR扩增5个持家基因序列，包括aroA(编码5一烯醇丙酮莽草酸．3．磷酸合酶)、愆叫(编码RecA蛋白)、pyrC(编码二氢乳清酸酶)、脚砌(编码苹果酸脱氢酶)、toxR(编码ToxR蛋白)，进行单基因和多基因系统进化树的构建和分析，

8、用于鳗孤菌基因型分析。结果显示，基于单个基因(除pyrC基因外)的系统进化树可以将01和03血清型鳗弧茵区分；基于5个基因位点序列的系统进化树可将鳗弧菌5种血清型区分。表明本研究建立的MLST可用于鳗弧茵的基因分型。关键词：鳗弧菌；血清学分型；基因分型；多位点序列分型(MLST)；生理生化