护肝清脂片对肝脂肪变性l02细胞模型的药理作用及机制研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文护肝清脂片对肝脂肪变性L02细胞模型的药理作用及机制研究Pharmacologicalef．fectsandmechanismsofHuganQingzhiTabletonhepaticsteatosisL02ceUmodel课题来源：国家自然科学基金(批准号：81274160)广东省自然科学基金(项目编号：S2012010)学位申请导师姓专业名培养类培养层所柱学人殷锦锦名周本杰称药剂学型学术型次硕士研究生院药学院答辩委员会主席答辩委员会委员刘叔文教授杨敏主任药师张军主任药师陈吉生主任药师

2、张守尧主任药师2014年5月27日广州硕士学位论文护肝清脂片对肝脂肪变性L02细胞模型的药理作用及机制研究硕士研究生：殷锦锦指导教师：周本杰摘要研究背景脂肪肝(￡lttyliver)是一种由多种原因引起的肝脏脂肪代谢紊乱，根据病因的不同，临床上将脂肪肝分为酒精性脂肪肝病(alcoholicfa竹yliverdisease，AFLD)和非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic蠡lny1iverdiseaSe，NAFLD)。在我国，AFLD流行并不严重，所占脂肪肝的比重较低，脂肪肝主要还是以NAFLD为主。NAFLD是指除酒

3、精和其他明确的损肝因素外所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为主要特征的临床病理综合征，包含单纯性脂肪肝以及由其进展的非酒精性脂肪性肝炎烈AsH)、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。作为代谢综合征的肝脏表现，NAFLD是肥胖、2型糖尿病、心血管疾病等的重要危险因素。在不同的国家当中约有14％~24％的人患有NANLD，肥胖人群中高达57．5％～74％，近年来呈现低龄化趋势，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病和威胁人类健康的重要隐患。NAFLD的发病机制较为复杂，体内脂质代谢动态平衡失调，导致脂类物质肝脏过度贮存是其主要发病机制，因此

4、，肝脏脂质代谢紊乱的机制研究成为一个必要的课题。越来越多的研究表明，过氧化物酶体增殖物激活受体Ⅱ(peroxisomeproliferatorActivatedrecepto卜a，PPARcc)是体内脂质平衡的生理传感器，在脂质代谢和NAFLD发病机制中发挥重要的作用。它高表达于高能量代谢组织如肝摘要脏、肾脏、骨骼肌、心脏及血管壁等。PPAR0【几乎参与脂质代谢的所有过程，主要调节与脂肪酸摄取有关的脂肪酸结合蛋白及脂肪酸转运蛋白、与肝内脂肪合成相关的脂肪酸合成酶以及与载脂蛋白代谢相关的A口oC．III，最终调节脂肪酸的摄取

5、和／或结合及脂质代谢。研究发现，PPAR0【的合成配体非诺贝特能降低甘油三酯、增加高密度脂蛋白、胆固醇的水平。另有实验证明PPARn的缺乏或表达受抑，都能引起与肝内脂肪酸代谢有关的一系列蛋白质、酶基因的转录水平降低，导致脂质合成的增加和脂肪酸在肝脏氧化代谢的减少，进而引起脂肪在肝细胞内沉积，从而导致脂肪肝形成，这些都有力地说明了PPAR。【与肝脏脂质代谢的调节以及NAFLD的发病有密切联系。当前尚无一种特异性的NAFLD治疗手段或药物，临床上多以降血脂、保护肝细胞等药物为主，但疗效欠佳。护肝清脂片来源于名老中医、军委保健医

6、藏垄堂教授在长期临床工作中总结出来的经验方，全方由泽泻、山楂、蒲黄、三七、荷叶、陈皮等六味中药组成。前期动物实验结果显示，护肝清脂片具有良好的改善高脂饮食诱导的№虹LD模型大鼠高血脂、胰岛素抵抗等药理作用，然而护肝清脂片防治NAFLD的作用机制尚不明确，这大大限制了它的临床推广应用。因此，本实验运用中药血清药理学方法，制备护肝清脂片药物血清，系统观察其对肝脂肪变性L02细胞模型的药理作用，同时采用现代分子生物学手段从脂质代谢PPAR伍信号通路初步探讨其相关作用机理，明确其作用靶点，从而为其临床推广应用提供科学依据。目的本课

7、题运用中药复方血清药理学方法，采用油酸和棕榈酸混合物(油酸：棕榈酸=2：1)建立非酒精性肝脂肪变性细胞模型，旨在研究护肝清脂片药物血清对于非酒精性肝脂肪变性细胞模型的具体药效，Real一timePCR和Westemblotting同步检测脂质代谢相关通路．PPAR旺信号通路分子的表达，旨在从细胞水平上探讨护肝清脂片对NAFLD脂肪变性的干预作用以及对脂质代谢的调控机理。II硕士学位论文方法(1)以人肝L02细胞为研究对象，给予含不同浓度的游离脂肪酸(FFA)(棕榈酸与油酸的混合物，棕榈酸：油酸=2：1)的培养基培养24h，

8、通过MTT法测定细胞活性，结合油红0染色及细胞内TG的测定，筛选制备肝细胞脂肪变性模型的最佳游离脂肪酸浓度和最佳造模时间。(2)采用乳酸脱氢酶(LDH)测定法确定护肝清脂片药物血清添加比例。(3)待细胞长满70％、，80％时，分为正常对照组、模型组、护肝清脂片低、中、高剂量药物血清组和非诺贝特药物血清组