非蛋白质氨基酸的酶促合成及其作为中间体参与新药合成的研究

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1、分类号：密级：学校代码：10165学号：201111192遣掌研藏犬擎硕士学位论文⑨非蛋白质氨基酸的酶促合成及其作为中间体参与新药合成的研究作者姓名：学科、专业：研究方向：导师姓名：徐洁细胞生物学细胞工程赵春晖副教授2014年05月lIIill11111Iilllllllll111111111111IIIIIIl学位论文独创性声明一Y一2—6m37本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对

2、本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。学位论文作者签名：盗垂学位论文版权的使用授权书本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后使用本授权书。学位论文作者签名：盗至叁指导教师签名：一签名日期：年

3、月日辽宁师范大学硕士学位论文摘要D．乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(D．acetylserinesulfhydrylase，OASS)是大肠杆菌硫酸盐同化途径及半胱氨酸合成中重要的生物酶之一，和丝氨酸乙酰转移酶(Serineacetyltransferase，SAT)以酶复合体的形式存在，通常被称为半胱氨酸合酶(Cysteinesynthase)。在微生物和植物细胞内，OASS和SAT将环境中的无机硫还原成．2价的硫，经二步酶催化途径由L．丝氨酸合成L．半胱氨酸。首先以丝氨酸和乙酰辅酶A为底物，在SAT催化下，合成D

4、．乙酰丝氨酸(D．acetylserine，OAS)和辅酶A；然后在OASS的催化下，通过硫化物将OAS转化为半胱氨酸。通过替代第二步反应中底物，OASS能够利用各种亲核试剂合成出非蛋白质氨基酸。非蛋白质氨基酸是自然界存在的蛋白质中发现的20种氨基酸以外的其他氨基酸，因其丰富了肽链的多样性，为跨越20种天然氨基酸屏障，人工合成蛋白质提供了基础材料，是国内外合成肽类、类肽类药物的主要成分，也是合成手性药物的极具吸引力的侯选基础材料，是众多新药的关键中间体，在科研和医药领域用途广泛。本论文以大肠杆菌Escheric

5、hiacoli假coli)DH5a基因组DNA为模板，PCR扩增得到大小为972bp的D．乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶A(OASS．A)基因cysKORF区基因片段，将目的片段与表达载体pET．22b(+)相连，得到重组质粒CysK-pET．22b(+)，转化到表达菌中，筛选诱导表达条件，进行蛋白纯化，获得高浓度可溶的OASS．A重组蛋白。以O．乙酰丝氨酸(oas)为底物，对得到的重组蛋白进行酶活性检测，测得纯化的重组蛋白的活性单位为750U／mg，酶的粗提液中重组蛋白的活性单位为400U／mg。以重组OASS．A

6、作为酶催化剂，D乙酰丝氨酸和苯硫酚作为底物，合成非蛋白质氨基酸§苯基．L．半胱氨酸(S-phenyl-L．cysteine，S．P．C)，通过高效液相色谱和核磁共振技术对产物结构进行鉴定，得到高纯度的S．P．C。建立了通过得到大量的活性稳定的重组酶作为生物催化剂，高效率合成非蛋白质氨基酸的有效模式。根据药物拼接原理，将S．P．C与活性化合物积雪草酸、脱氧胆酸的有效基团进行偶联，对产物进行结构鉴定，并初步检测合成产物对癌细胞增殖影响初步检测，MTT实验结果显示，合成的终产物均具有一定的增殖抑制作用。关键词：非蛋白

7、质氨基酸；酶法合成；萨乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶；S-苯基一L一半胱氨酸非蛋白质氨基酸的酶促合成及其作为中间体参与新药合成的研究Enzymaticsynthesisofnon—proteinaminoacidsandtheiruseasintermediatesinvolvedinthesynthesisofnewdrugsAbstractO-acetylserinesulfhydrylaseA(OASS)iSanimportantenzymeintheassimilationpahwayofsulfateand

8、cysteinesynthesis．Itpresentsasanenzymecomplexformtogether谢thserineacetyltransferase(SAT)inthesynthesisofcysteine．usuallycalledcysteinesynthase．L-Cysteinebiosynthesisinmicroorganismsandhigherplan