色氨酸及非天然氨基酸酶法合成研究

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1、ADissertationSubmittedtoNanjingUniversityfortheDoctor'SDegreeofScienceSynthesisofTryptophanandNon-naturalAminoAcidsCatalyzedbyRecombinantEnzymesByGenhaiZhaoSupervisedbyProf．QingcaiJiaoSchoolofLifeScience,NanjingUniversity,Nanjing'ERChina2011．2．282008指导教师(姓名、职称)：筮廛茎塾撞摘要手

2、性是自然界的基本属性之一，构成生命有机体的分子绝大多数都是不对称的手性分子，这些大分子在生命体内具有重要的生理功能。氨基酸作为一种常见的手性化合物，广泛应用于医疗、食品、保健品及饲料等与人类生活和健康密切相关的几大行业。其中，D．氨基酸作为医药及食品领域的重要原材料，被广泛用于半合成抗生素、多肽激素、杀虫剂和甜味剂等生产。一般而言，氨基酸的生产方法有发酵法、化学合成法和酶法合成。酶法合成与普通化学合成相比，具有高效、环保、安全和适合大规模生产等优点。随着人们环境意识的增强，资源综合利用，清洁生产，低碳节能已成为全球发展的大趋势。以最小

3、的环境影响，最少的资源消耗，最优的管理模式实现最合理的经济增长，走可持续发展之路已成为各国经济社会发展的共识。本文利用自主构建的大肠杆菌工程菌，进行了一系列D．p一羟基一氨基酸、D．氨基酸和非天然L．氨基酸酶法合成研究；利用高活性、高选择性和盐耐受性的基因工程菌，以角蛋白水解母液为原料，酶法合成高附加值L．色氨酸；同时对大肠杆菌基因工程菌发酵培养基组成及发酵条件进行了优化。具体工作如下：1．重组表达了丝氨酸羟甲基转移酶，该酶具有广泛的底物特异性，可以DL苏式．羟基氨基酸为底物光学拆分获得D．B．羟基氨基酸。在论文第二章，以苯甲醛及其衍

4、生物为原料化学合成了DL．苏式．羟基氨基酸，研究了该酶对不同DL．苏式．羟基氨基酸的Km值和Vmax等动力学常数，优化了酶促反应条件，最适条件为：pH7．5，反应温度45。C，底物浓度200mmol／L。经酶法拆分后，产物光学纯度达97％以上。经固定化处理，酶的操作稳定性显著提高，固定化细胞可以连续使用10次，前5次的平均转化率为84．1％。2．重组表达了色氨酸合成酶和色氨酸酶，前者能以丝氨酸为底物合成色氨酸，后者能以丝氨酸或半胱氨酸为底物合成色氨酸。在以角蛋白水解母液为底物时，色氨酸合成酶表现出明显优势，物料中丝氨酸转化率达95．1

5、％，转化液色氨酸浓度可达33．2g／L。最适条件为：pH8．0，反应温度40。C，0．04％的吐温．80f10％v，v)。在75g／L氯化铵浓度条件下，色氨酸合成酶的催化活性无明显降低，预示该酶在工业化应用中具有极大地潜力。建立了转化体系中半胱氨酸、色氨酸浓度的跟踪检测方法，以二价铜离子和二甲酚橙为显色剂，在pH6．0醋酸钠缓冲液中，可定量测定酶转化液中半胱氨酸含量。以1：3(v／V)甲酸和盐酸为显色剂，可定量测定酶转化液中色氨酸含量。3．重组表达了芳香族氨基酸转氨酸，该酶能将氨基供体上的氨基转移到酮酸上生成相应的氨基酸。本论文第四章

6、合成了4．甲砜基苯丙酮酸系列衍生物，并以之为氨基受体，三种芳香族氨基酸、三种支链氨基酸、二种酸性氨基酸等为氨基供体，研究了芳香族氨基酸转氨酸的催化活性。发现以L．色氨酸为氨基供体、4．甲砜基苯丙酮酸为氨基受体时，酶的催化效率最高，反应平衡时氨基受体的转化率达84．4％。最适条件为：转化温度40。C，pH8．5。该方法同样适用于L．4．硝基苯丙氨酸和L．4．甲氧基苯丙氨酸的合成，为酶法合成其它非天然氨基酸衍生物提供了新思路。4．以重组天冬氨酸酶为例，运用Plackett．Burman和Box．Behnken设计，从11个发酵相关的影响因

7、素中筛选出4个重要因素，并研究了因素间的交互作用。对分析结果的放大验证实验发现，1．05％(m／v)的蛋白胨、8．23％(m／v)的玉米浆、1．12％(m／v)的乳糖、培养20．78h的理论酶活为3985U，实际酶活为4100．5U。优化后，天冬氨酸酶的初始反应速率、底物浓度及转化率均有不同程度的提高。本论文着眼于国家氨基酸产业发展趋势，立足于企业发展实际需求，以生物酶法开发利用工农业生产副产物，为环境友好、资源节约、低碳高效的可持续发展道路做出了积极地探索。同时以化学生物耦合法合成多种重要手性药物前体，制备多种手性非天然氨基酸化合物

8、，具有重要的理论意义和应用潜力。关键词：丝氨酸羟甲基转移酶，色氨酸合成酶，色氨酸酶，角蛋白酸水解母液，D．D．羟基氨基酸，L一色氨酸，非天然氨基酸，表面响应方法，生物催化IITHESIS：Synthesisoftrypt