草鱼(ctenopharyngodon idellus)sp1的克隆及其表达研究

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1、CLOININGANDEXPRESSION0FTRANSCRIPTIONFACTORSplFROMcTENoPHARYNGoDoNIDELLUSADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniv，ersityinPartialFulfillmentoftheRequirement．sfortheDegreeofMasterofBiochemistryandMolecularBiologyByHaoGuangSupervisor：mj．Profess

2、orWangJunliAdj．ProfessorLiuZhenMay,2014摘要转录因子Spl(Specificityprotein1)可调控多种基因的激活，参与多数细胞的生长分化和细胞周期代谢，与肿瘤的发生密切相关。本研究利用T-A和RACE技术从草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肠道克隆出SplcDNA全序列，采用实时荧光定量PCR技术检测了草鱼不同组织、不同发育时期印Jf基因的表达，并探讨了在日粮中添加不同蛋白源、不同蛋白水平和谷氨酰胺二肽等营养素对草鱼印J基因表达的调控。1、草鱼勋1

3、cDNA克隆及生物信息学分析草鱼印J『cDNA全长为1914bp，包括1482bp的编码区、5bp的5’UTR和426bp的3'UTR，共编码493个氨基酸。等电点为8．27，主要的元素成分含量为C：2．23％，N：4．87％，H：2．43％，S：9．94％，T：11．16％。分子式为C2237H3600N6620738S20。氨基酸组成中，Thr(11．2％)和Gin(10．1％)含量相对较高。氨基酸序列的疏水性：MAX，2．93；MIN，．1．89。磷酸化位点：Ser21个，Thr7个，Tyr2个。系统进化分

4、析表NSpl在进化上比较保守，与鲤科鱼中的斑马鱼(Danmrerio)亲缘关系最近，同源性达66％。2、草_鱼spl基因的时空表达采用RT-qPCR检测印J基因在草鱼心脏、肝胰脏、脾脏、肾脏、肌肉、垂体、鳃、脑、前肠、中肠和后肠等组织的表达差异。结果表明：印J7mRNA在草鱼中肠和鳃中表达最高，后肠和脑次之，其余较低；胚胎发育过程中，共检钡tJlO个时期印JmRNA相对表达量，出膜前的表达量明显高于出膜后。出膜前各时期的表达量波动较大，原肠期和器官期表达显著，囊胚期次之，出膜前期表达量降至最低，并在出膜后一直维持

5、较低水平，只在出膜期第3天有短暂上调。3、外源蛋白对草鱼印j基因表达的影响本实验以体重为11．554-0．4591拘健康草鱼为研究对象，探讨日粮中不同蛋白源和不同蛋白水平对草鱼印J『基因表达的影响。在不同蛋白源实验中，分别采用鱼粉、豆粕和鱼粉+豆粕作为饲料蛋白；在不同蛋白水平实验中，分别在饲料中添力H22％、27％、32％、37％和42％的粗蛋白。同时进行养殖实验，并在养殖的第7d、第14d、第21d和第28d，采用RT-qPCR技术检测中肠印JmRNA的相对表达量。不同蛋白源实验结果表明：随着饲喂时间的延长，印

6、JmRNA表达量在3组实验鱼中T均呈先升高后下降的趋势，且均在饲喂21d时达到最高值。每个时期的表达量均为：混合组>鱼粉组>豆粕组。在第7d、第14d和第21d，混合组的表达量均显著高于鱼粉组和豆粕组，N28d时，鱼粉组的表达量与混合组不再有显著性差异。以上结果说明混合蛋白源对草鱼印珀勺表达具有更强的上调作用，且鱼粉优于豆粕。随着饲喂时间的延长，日粮中添加不同蛋白水平对草鱼肠道印JmRNA表达量的影响表现出与不同蛋白源实验相同的规律，即印J『mRNA表达量在饲喂5种不同蛋白水平饲料的实验鱼中均呈先升高后下降的趋势

7、，且均在饲喂21d时达到最高值，说明印J『mRNA的表达与草鱼的生长发育有一定关系。除第7d各组的勋J『mRNA表达量无差异外，每个’时期均为27％粗蛋白添加组最高，且与其他组均有显著性差异(p22％组>32％组>37％组>42％组，说明日粮中添力1：127％左右的粗蛋白可以更好地促进草鱼肠道印珀勺表达，蛋白含量偏高或偏低都可能会起抑制作用。4、谷氨酰胺二肽对草鱼印J基因表达的影响利用RT-qPCR方法检测日粮中添加不同剂量谷氨酰胺二肽对草鱼肠道勋J

8、mRNA表达的影响，结果表明：随着添加量的增加，印JmRNA表达量呈先升高后下降的趋势，添加量为5．0g／Kg时，勋JmRNA达到最高值，之后显著降低。说明适量的外源谷氨酰胺二肽对草鱼肠道印J『mRNA表达有促进作用。关键词：草鱼，转录因子Spl，实时荧光定量，蛋白，谷氨酰胺二肽IIABSTRACTTranscriptionfactorSpl(Specificitypro