人类胚胎干细胞诱导性多能干细胞向成熟的嗜碱性粒细胞诱导分化及其生物学特性的研究

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1、苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名．违焘盗日期：艘／。2．．今．易苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、

2、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在——年一月解密后适用本规定。非涉密论文口论文作者签名：查查鱼日导师签名：舡日期：幽／02．弓、彬指导小组成员马峰教授薛群副主任医师人类胚胎干细胞／诱导性多能干细胞向成熟的嗜碱性粒细胞诱导分化及其生物学特性的婴窒!茎塑至中文摘要人类胚胎干细胞(humanembroynicstemcells，hESCs)及人类诱导性多能干细胞(indu

3、cedhumanpluripotentstemcells，hiPSCs)具有无限增殖及多向分化潜能，这不仅为再生医学研究提供了潜在的细胞来源，而且为建立疾病特异性疾病模型开展研究，以及最终的个体化治疗提供了良好的物质基础。由hESCs分化而来的造血干细胞已经被成功地诱导分化为具有功能的红细胞、中性粒细胞、血小板、巨核细胞、单核细胞、树突状细胞(Dc)、自然杀伤细胞(NK)和功能未确定的T、B淋巴细胞，而从hESCs分化诱导嗜碱性粒细胞的相关工作至今尚无报道。嗜碱性粒细胞(basophils)是起源于骨髓多能造血干细胞，在骨髓内分化成熟后进入外周血的一类细胞群。其表型及其部分特性和嗜酸性粒细胞以

4、及肥大细胞相似。嗜碱性粒细胞在介导过敏反应与发挥免疫调节作用中具有重要的功能，并且在增强免疫应答记忆等方面发挥作用。鉴此，探讨嗜碱性粒细胞分化发育途径涉及调控机制具有重要的理论和研究价值。嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞均具有相似的细胞表型和功能。这三种细胞的早期发育至今都存在着争议。有研究表明，嗜碱性粒细胞早期与嗜酸性粒细胞一起发育，也有研究认为嗜碱性粒细胞与肥大细胞的早起发育是一条途径。因此从hESCs／hiPSCs向嗜碱性粒细胞分化发育的研究将有助于解决这一科学问题的价值。鉴此，本研究探索性建立由hESCs／hiPSCs来源的、诱导分化成熟的嗜碱性粒细胞的培养方法，在此

5、基础上对其生物学功能进行初步探讨。第一部分hESCs／hiPSCs向早期造血干细胞分化及其生物学特性【目的】建立hESCs／hiPSCs向早期造血干细胞分化的方法，并对hESCs／hiPSCs诱导分化的造血干细胞生物学特性进行比较。【方法】①从小鼠胚胎中分离培养小鼠胚胎成纤维母细胞(mouseembrynicfibroblast，MEF)细胞，体外扩增，并作为滋养层与人类胚胎干细胞系(H1)，人类诱导性多能干细胞(G1、G4、B6、B7)共培养保持其生长和未分化能力。②用未T中文摘要人类胚胎干细胞／诱导性多能干细胞向成熟的嗜碱性粒细胞诱导分化及其生物学特性的研究分化的hESCs／hiPSCs分

6、别与小鼠主动脉．性腺。中肾区(AGM)成纤维细胞共培养，诱导分化成早期造血干细胞。③经流式细胞仪检测分析这几组诱导分化后的早期造血干细胞表面标志物特征。④经PT-PCR检测hESCs诱导的早期造血干细胞的基因表达。【结果】①经体外分离、消化、传代培养出大量的MEF细胞，作为hESCs／hiPSCs的滋养层细胞，促使其快速生长繁殖而不分化。②经未分化的hESCsNiPSCs与小鼠AGM成纤维细胞共培养诱导14d后，可以成功诱导出大量的早期造血干／祖细胞。③通过流式检测分析，发现经本实验诱导培养的早期造血干／祖细胞具有向红系、内皮系、髓系等细胞分化的能力，进一步证实了本实验所采用培养方法能大量有效

7、诱导出早期二次造血干／祖细胞。④经过RT-PCR的检测发现本实验的诱导培养方法早在共培养阶段就可以检测到早期造血调控所必须的基因CD34、c—kit、GATA一1的表达，进一步证实了本方法诱导培养出早期造血干／祖细胞的有效性。【结论】通过hESCs／hiPSCs与小鼠AGM成纤维细胞共培养方法可以大量、有效地诱导出早期的二次造血干细胞。第二部分hESCsmiPSCs向成熟嗜碱性粒细胞诱导分化及生物