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博士学位论文诱导多能干细胞向生殖细胞分化的实验研究DERIVATIONOFGERMCELLSFROMINl3UCEDPLURIPOTENTSTEMCELLS姓名：学号：指导教师：申请学位：学科专业：研究方向：培养单位：基金资助：蔡恒0087109023徐晨教授博士人体解剖与组织胚胎学生殖生物学基础医学院国家重点基础研究发展计划(2010CB945201)2012年5月 上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：蒋恒日期：刀，)年，月7日 上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于|不保密倒。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者签名：搽恒指导教师签名：日期：夕f声年上月7日日期：2口，2年岁月矿日 诱导多能干细胞向生殖细胞分化的实验研究摘要近年来，在世界范围内，男性精子的数量和质量呈下降趋势，男性不育症的发病率在逐年上升，其中约50％是由于生精障碍所致。干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，是生命科学领域的研究热点之一。自2006年，来源于体细胞的诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPS细胞)诞生以来，由于iPS细胞具有与胚胎干细胞(embryonicstemcells，ES细胞)相似的特性，且来源广泛、取材方便，可以获得疾病或患者特异性的iPS细胞，且不涉及免疫排斥、医学伦理学等问题，具有ES细胞所不能比拟的优势，因而受到了广泛关注。目前，ES细胞向生殖细胞分化的研究已经取得了一定的成果，而iPS细胞定向诱导分化的研究较少。在本研究中，我们通过体内、体外两种途径诱导iPS细胞分化，探讨其向生殖细胞分化的潜能，希望为研究生殖细胞的发育提供实验依据，为研究不育症的发病机制及细胞替代性治疗提供新思路。在体实验中，我们先后将新生小鼠睾丸组织、睾丸细胞移植至裸鼠背部皮下组织，发现睾丸组织可在异位完成精子发生过程，移植的睾丸细胞可定植、聚集，形成管状结构，观察到了精原细胞在管中的迁移和增殖，新生小鼠睾丸细胞在皮下重构形成了生精小管样结构，从而说明裸鼠皮下组织可以提供精子发生的微环境。在此基础上，我们将小鼠EGPF．iPS4．1细胞与新生小鼠睾丸细胞共同移植至裸鼠皮下，探讨iPS细胞向生殖细胞的分化潜能。在移植物中可以检测到EGFP．iPS4．1来源的、表达生殖细胞特异性标志物的细胞，表明iPS细胞可在此微环境下向生殖细胞分化。在体外培养体系中，我们在形成类胚体(EB)的基础上，以维甲酸(RA)等作为诱导分化因子，通过形态学观察、RT．PCR、流式细胞分析术、免疫荧光等检测方法研究EGFP．iPS4．1细胞在体外向生殖细胞分化的潜能。RT．PCR结果显示，iPS细胞 在形成EB的过程中表达一系列雄性生殖系的标志性基因。流式细胞分析术的结果显示，在EB中存在SSEA．1+／integrin．133+的一类细胞，可认为是原始生殖细胞。我们将这一类细胞在含有RA的条件培养基中培养，逐渐有细胞克隆形成，并可扩增传代。此类细胞克隆呈碱性磷酸酶阳性，表达干细胞多能性标志蛋I刍Oct4和生殖细胞特异性标志蛋白MVH，说明其为生殖干细胞。综上，我们的研究表明，EGFP．iPS4．1细胞具有与ES细胞相似的特性，可以在体内、体外诱导条件下向生殖细胞分化。关键词诱导多能干细胞精子发生诱导分化微环境生精小管异位重构生殖干细胞 DERlV『ATIONOFGERMCELLSFROMINDUCEDPLURIPOTENTSTEMCELLSABSTRACTInrecentyears，theincidencerateofmaleinfertilityhasbeenincreasingallovertheworld，about50％ofwhichiscausedbyspermatogenesisdysfunction．Basedonitsself-renewalpropertyandmultilineagepotentials，stemcellbecameaverypowerfultechniqueforregenerativemedicine，andaresearchfrontierandhotspotofthelifesciences．Inducedpluripotentstem(ms)cellsderivedfromsomaticcellsisasignificantprogressinstemcellresearch．Comparedwithembryonicstem(ES)cells，iPScellsovercometheproblemsasthescarcityofresources，theimmunologicrejectionandtheethicalqueries．Besides，patient—specificiPScelllinecouldbeusedforcustomizedmedicine，whichhasapromisingfutureinclinicalapplication．Todate，therehavebeenreportsongerm-likecellsdifferentiatedfromEScellsinvitro．IfthisroutinecouldbereplicatedsuccessfullyiniPScells，thenitmightbecomeabreakthroughinthetherapyofreproductivefailure．Inthisstudy,weworkedtoinducedmouseiPScellsdifferentiatingintogermcells，bothbyapproachesinvivoandinvitro．Inaninvivomodel，weusingimmunodeficientmouseasrecipientanimals，graftedneonatalmousetesticulartissueintothedorsalsubcutaneousofthenudemice．Wefoundthetransplantedtissuescouldsurviveandcompletedthespermatogenesisinthatmicroenvironment．WhentheneonataltesticularcellsuspensionWasxenograftedintothedorsalregionofthenudemice，seminiferoustubulescouldbeectopicallyreconstituted．Spermatogoniacellswerehominganddevelopinginthesetubulesstructures．Accordingly,whenmouseEGPF．iPS4．1cellswereCO．graftedwiththeneonataltesticulareellsuspension，wedetectediPS-derivedcellswithexpressionofgermcellmarkers．Thismodelconstructedareliablenichewhichcouldsupportthegermcelldifferentiation． Inall伽vitromodel，weinvestigatedthemalegermlinepotentialofEGPF—iPS4．1byexperimentsasembryoidbody(EB)formation，morphology,RT-PCR，flowcytometryandimmunofluorescenceassay．DuringtheEBformation，aseriesofgermlinemarkergeneswereexpressed．Flowc”ometrydemonstratedthattherewasagroupofSSEA-l十／integrin-D3十cellsinEB，whichrepresentedtheprimordialgermcells．WethenseededthesecellsonMEFfeedercells，culturedwithinducerretinoicacid(RA)pluscytokinesincludingLIF，bFGF,andSCF．Stemcell·likecoloniesemceed，positiveforAKPactivity,pluripotentmarkerOct4，aswellasthemalegermlinemarkerMVH．ThesecellclonescouldbeexpandedandpassagedasmouseES／iPScells．Wedesignatedthemasgermstemcells(GSC)．OurfindingsrevealedthatEGFP·iPS4．1couldbeinducedtodifferentiatingintogermcells．KEYWORDS：Inducedpluripotentdifferentiation，niche，ectopicreconstitutionstemcell(iPS)，spermatogenesis，inducedofseminiferousmbules，germstemcell 目录绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1第一部分生精小管异位重构的小鼠实验研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．6第一章新生小鼠睾丸组织异位移植重构生精小管⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．101．2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．151．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．22第二章新生小鼠睾丸细胞异位移植重构生精小管⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．252．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．262．2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．282．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31第三章iPS细胞在异位重构组织中向生殖细胞分化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．343．2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．353．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．39小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．40参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41第二部分诱导iPS细胞向生殖细胞分化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．494．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．504．2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．604-3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．68小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．70参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．70结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一74综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．75致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．96 缩略词表英文缩写英文全称中文全称AKPalkalinephosphatase碱性磷酸酶APES3-aminopropyl—triethoxysilane3。氨丙基．3．乙氧基甲硅烷bFGFbasicfibroblastgrowthfactor碱性成纤维细胞生长因子BMPbonemorphogeneficprotein骨形态形成蛋白bpbasepair碱基对BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白cDNAcomplementarydeoxyribonucleicacid互补脱氧核糖核酸dday天DABdiaminobenzidine二氨基联苯胺DAPI4’，6-diamidino一2-phenylindole4·，6．二脒基．2．苯基吲哚ddH20doubledistilledwater双蒸水DEPCdiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯DMEMDulbecco’smodifiedEagle’smedia杜氏改良Eagle培养基DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜DPBSDulbecco’Sphosphatebufferedsaline杜氏磷酸缓冲液dpcdaypostcoitum交配后天数EBembryoidbody类胚体EDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸EGFPenhancedgreenfluorescentprotein增强型绿色荧光蛋白EScellembryonicstemcell胚胎干细胞FACSfluorescence-activatedcellsorting荧光活细胞分选FBSfetalbovineseBlm胎牛血清FSHfolliclestimulatinghormone卵泡刺激素 gGFPGIlIjⅢhHEICSIICMIFiPScell1LCSMLIFLHMM匝FmgIImlmlmMMVH0ct4PASPBSPCRPEPFAgramgreenfluorescentproteingonadotrophinreleasinghormonehourhemotoxylinandeosinintracytoplasmicsperminjectioninnercellmassimmunofluorescenceinducedpluripotentstemcellsliterlasercon_focalscanningmicroscopyleukemiainhibRoryfactorluteinizinghormonemolar／litermouseembryonicfibroblastmilligramminutemillilitermillimolar／1mouseVASAhomologoctamer-bindingtranscriptionfactor-4Periodicacid．Schiffstainphosphatebufferedsolutionpolymerasechainreactionphycoerythinparaformaldehyde克绿色荧光蛋白促性腺激素释放激素小时苏木精．伊红卵细胞质内单精子注射内细胞群免疫荧光诱导多能干细胞升激光共聚焦扫描显微技术白血病抑制因子黄体生成素摩尔／升小鼠胚胎成纤维细胞毫克分钟毫升毫摩尔／升小鼠VASA同源基因八聚体结合转录因子4过碘酸席夫染色磷酸盐缓冲液聚合酶链反应藻红蛋白多聚甲醛 PGCSRARNArpmRT．PCRSSCFSCP3SSCprimordialgermcellsretinoicacidribonucleicacidrevolutionsperminute原始生殖细胞维甲酸核糖核酸每分钟转数reVerse廿孤scripti。np。lymerasechain反转录聚合酶链反应reactionsecondstemcellfactorsynaptonemalcomplexprotein3spermatogoniastemcellSSEA-1stage-specificembryonicantigen-1S仃a8TTAE烬山IxmtxMWWHOstimulatedbyretinoicacidgene8testosteroneTrisacetatesaltn[ucro。grammicrolitermicrometermicromolar／literweekWorldHealthOrganization秒干细胞因子联会复合体蛋白3精原干细胞阶段特异性胚胎抗原视黄酸激活基因8睾酮三羟甲基氨基甲烷醋酸盐微克微升微米微摩尔／升周世界卫生组织 上海交通大学博士学位论文绪论生殖健康是人类健康的重要基石之一。据世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)统计，约10％一15％的夫妇婚后1年不育，其中50％由于男方因素所致[1]。精子生成障碍、精子输送管道病变、免疫性不育、附属性腺异常、生殖道感染等均可引起不育，在这些因素中，以精子生成障碍所占的比重最大，这与现代社会生活节奏加快、生存压力加大、环境污染加剧等密切相关。近年来，我国男性不育症患者呈逐年增长的趋势，因此，男性不育问题已经成为男性生殖健康的焦点，也是迫切需要关注和解决的重要问题。生殖细胞因具有将基因组的信息传给子代的功能，在动物的生命周期中起着举足轻重的作用[2】。因此，研究生殖细胞的发育及其机制对于阐明不育症的病因、提高其诊断治疗水平具有重要的现实意义。随着科学技术的发展和研究手段的不断提高，大大加深了人们对睾丸发育和精子发生的认识，然而，生殖细胞在出生后的发育以及非啮齿类动物的精子发生尚缺乏深入的了解【3]，缺乏合适的体内、体外研究模型是一个主要原因。哺乳动物的精子发生是一个复杂而独特的细胞分裂、分化过程【4，5】，包括三个阶段【6】：即精原细胞的增殖、精母细胞的减数分裂和精子形成。精子发生受多种激素、因子的精密调控，睾丸支持细胞(Sertoli细胞)作为唯一与生精细胞接触的体细胞，以其独特的结构和功能为精子发生提供适宜的微环境，对生精过程起着至关重要的调控作用。在哺乳动物胚胎发育过程中，生殖细胞起源于靠近卵黄囊的胚外区域的原始生殖细胞(primordialgermcells，PGCs)。PGCs逐渐迁移到达生殖嵴，形成生殖腺；之后，雄性个体的PGCs发育、分化形成精原干细胞(spermatogoniastemcell，SSCs)；青春期后，精子发生过程启动，SSCs向精子定向分化[7】。由此可见，SSCs的分离和体外培养是开展精子发生的基础和临床研究中的关键步骤。目前，国内外在对人类和多种动物的SSCs的分离、筛选、体外培养及体内、体外分化实验方面，已经有了一定的基础[8，9】。涉及到的技术有：睾丸细胞的激光显微切割，SSCs的免疫磁珠分选、超低温冷冻、转基因，SSCs睾丸生精小管移植，以及卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmicspermmjecfion，ICSI)技术等。但在 上海交通大学博士学位论文生精障碍患者的睾丸中，SsCs非常罕见，分离相当困难。胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES细胞)是从囊胚期的内细胞群(innercellmass，ICM)中分离出的多能性干细胞，可在体内分化为包括生殖细胞在内的几乎所有类型的细胞【10．15]。在实验研究中，ES细胞经体外诱导培养或进一步移植入体内睾丸生精小管，可以分化产生有功能的精子细胞，并产生后代[16】。ES细胞或SSCs分化而来的生殖干细胞(germstemcells，GSCs)细胞可在体外进一步分化为有功能的精子细胞【17】。将SSCs或GSCs细胞移植回生精障碍的小鼠睾丸，可以部分重建生精功能【18]。然而，研究人ES细胞向生殖细胞的分化，势必涉及到伦理学问题、移植中的免疫排斥等问题，大大限制了其发展和应用。2006年以来，小鼠和人类诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPS细胞)的建系成功，为干细胞的研究和应用开辟了新途径【18．21】。成体细胞经外源性特定因子诱导重编程形成的iPS细胞，在形态学、增殖特性、干细胞标志物的表达、表观遗传学修饰等许多方面都表现出与ES细胞一致的特性[22]。2009年，科研人员证明了iPS细胞的全能性[23，24]，从而说明完全通过体外操作可以得到与ES细胞具有同样分化能力的细胞，这大大拓展了iPS细胞的应用前景。并且，iPS细胞从成体细胞诱导而来，避免了使用ES细胞的伦理困境，取材痛苦小，材料充足。因此，iPS细胞很有希望成为SSCs和雄(男)性生殖细胞的新来源。iPS细胞不仅对于基础研究具有重大意义，还有可能为人类某些疾病的治疗带来新的希望。首先将患者的体细胞诱导重编程为iPS细胞进行培养；再通过基因工程，修复iPS细胞中的基因缺陷；然后再将iPS细胞经体外诱导分化后、或直接移植回患者体内，发挥治疗作用。理论上可以解决干细胞材料稀缺和免疫排斥问题，可以进行各器官的、无限次的治疗。按照这一思路，用iPS细胞对人类镰状细胞白血病小鼠模型的治疗已经取得了初步成功【25】。因此，iPS细胞同样有望应用于男性生精障碍的治疗。在现有的辅助生殖技术(assistedreproductivetechnology，ART)中，父方的遗传缺陷很有可能被传递给下一代[26]。如果将生精障碍患者的体细胞重编程为iPS细胞，修复相关的基因缺陷，再移植回自体，就有可能重建生精功能；或者将修复后的iPS细胞直接在体外诱导分化为精子细胞，结合ART，就可以使男性不育患者拥有健康的后代。综上所述，iPS细胞向生殖细胞诱导分化的实验研究具有以下几重优势和意2 上海交通大学博士学位论文义：(1)它避免了使用ES细胞的伦理学困境，取材痛苦小，研究材料充足；(2)它提供了一个研究生殖细胞分化调控、生殖工程的新模型；(3)它具有治疗男性不育症的临床应用前景。本研究拟探讨精子发生过程中，微环境对生殖细胞的调控及二者之间的相互作用，探索体细胞来源的iPS细胞向雄性生殖细胞分化的发育潜能和调控机制，以期为iPS细胞应用于男性不育症的治疗提供实验依据和理论基础。实验的第一部分在生精小管异位重构的基础上，探讨精子发生所需的微环境，研究iPS细胞向生殖细胞分化的潜能；第二部分则在iPS细胞形成类胚体的基础上，利用维甲酸和条件培养基对其进行诱导分化，检测生殖细胞相关基因的表达及诱导效率，评价iPS细胞在体外向生殖细胞分化的潜能。参考文献Matzuk，M．M．andD．J．Lamb，Geneticdissectionofmammalianfertilitypathways．NatCellBiol，2002．4Suppl：P．s41-9．McLaren，A．，Primordialgermcellsinthemouse．DevBiol，2003．262(1)：P．1．15．Merchant-Larios，H．andN．Moreno-Mendoza，Onsetofsexdifferentiation：讲alogbetweengenesandcells．ArchMedRes，2001．32(6)：P．553-8．Huckins，C．，Thespermatogonialstemcellpopulationinadultrats．上Theirmorphology,proliferationandmaturation．AnatRec，1971．169(3)：P．533-57．Oakberg，E．F．，Spermatogonialstem—cellrenewalinthemouse．AnatRec，1971．169(3)：P．515-31．deKretser，D．M．，eta1．，Spermatogenesis．HumReprod，1998．13Suppl1：P．1-8．deRooij，D．G．andL．D．Russell，AHyouwantedtoknowaboutspermatogoniabutwereafraidtoask．JAndrol，2000．21(6)：P．776-98．Kubota,H．，M．R．Avarbock，andR．L．Brinster，Cultureconditionsandsinglegrowthfactorsaffectfatedeterminationofmousespermatogonialstemcells．BiolReprod，2004．71(3)：P．722—31．Ehmcke，J．andS．Schlatt，Arevisedmodelforspermatogonialexpansioninman：lessonsfromnon—humanprimates．Reproduction，2006．132(5)：p．3 上海交通大学博士学位论文10．11．12．13．14．15．16．17．18．19．20．21．22．23．24．25．673-80．Evans，M．J．andM．H．Kaufman，Establishmentincultureofpluripotentialcellsfrommouseembryos．Nature，1981．292(5819)：P．154-6．Martin，G．R．，Isolationofapluripotentcelllinefromearlymouseembryosculturedinmediumcondi玎onedbyteratocarcinomastemcells．ProcNatlAcadSciUSA，1981．78(12)：P．7634·8．Thomson，J．A．，etal，，Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts．Science，1998．282(5391)：P．1145-7．Nagy，A．，eta1．，Embryonicstemcellsaloneareabletosupportfetaldevelopmentinthemouse．Development，1990．110(3)：P．815-21．Tam，P．P．andJ．Rossant，Mouseembryonicchimeras：toolsfo，．studyingmammaliandevelopment．Development，2003．130(25)：P．6155-63．Chambers，I．，Themolecularbasisofpluripotencyinmouseembryonicstemcells．CloningStemCells，2004．6(4)：P．386-91．Toyooka，Y．，eta1．，Embryonicstemcellscanfo，7挖germcellsinvitro．ProcNatlAcadSciUSA，2003．100(20)：P．11457-62．Nayemia,K．，eta1．，Invitro—differentiatedembryonicstemcells∥vPrisetomalegametesthatcangenerateoffspringmice．DevCell，2006．11(1)：P．125．32．Izadyar，F．，eta1．，Autologousandhomologoustransplantationofbovinespermatogonialstemcells．Reproduction，2003．126(6)：P．765—74．Takahashi，K．，eta1．，Inductionofpluripotentstemcellsporeadulthumanfibroblastsbydefinedfactors．Cell，2007．131(5)：P．861—72．Yu，J．，eta1．，Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells．Science，2007．318(5858)：P．1917-20．Wemig，M．，eta1．，InvitroreprogrammingoffibroblastsintoapluripotentES-cell-likestate．Nature，2007．448(7151)：P．318·24．Boland，M．J．，eta1．，Adultmicegeneratedfrominducedpluripotentstemcells．Nature，2009．461(7260)：P．91-4．Zhao，X．Y．，eta1．，iPScellsproduceviablemicethroughtetraploidcomplementation．Nature，2009．461(7260)：P．86-90．Kang，L．，eta1．，iPScellscansupportfull-termdevelopmentoftetraploidblastocyst-complementedembryos．CellStemCell，2009．5(2)：P．135-8．Hanna,J．，eta1．，Treatmentofsicklecellanemiamousemode，wfthiPScells4 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上海交通大学博士学位论文第一部分生精小管异位重构的小鼠实验研究WHO规定，夫妇性功能正常、未采取避孕措施一年以上，由于男方因素造成女方不孕者，称为男性不育。近年来，随着生活节奏的加快，生存压力日益增加，环境污染不断加剧，人类精子的数量在悄然下降，其质量也出现了一定程度的衰退。在我国，约10％～15％的夫妇存在着生育障碍，男性不育症的发病率呈逐年上升的趋势，已经严重影响到男性健康，同时男性不育症给家庭的幸福蒙上了阴影，因此也是重要社会问题。导致男性不育的原因很多，如先天性发育异常、泌尿生殖道感染、精子生成障碍、精子输送管道病变、免疫性不育等[1]，这些因素中，以精子生成障碍所占的比例最大。精子发生是一个复杂的雄性生殖细胞增殖、分化的过程，包括三个阶段[2．4】：①精原细胞的分裂增殖[5】：精原细胞由A型精原细胞(包括SSCs)分化而来，通过有丝分裂不断增殖，一部分子细胞继续作为干细胞，这一过程即更新SSCs；另一部分则分化为B型精原细胞，B型精原细胞经数次分裂，分化为初级精母细胞。②精母细胞的减数分裂：根据细胞的发育阶段和染色质形态可将初级精母细胞分为前细线期、细线期、偶线期、粗线期及双线期等几个时期，期间发生同源染色体联会和遗传物质的重组。经过第一次减数分裂，一个双线期初级精母细胞产生两个次级精母细胞，次级精母细胞不发生染色体复制，迅速进入第二次减数分裂，生成单倍体的圆形精子细胞。③精子形成：圆形精子细胞经过复杂的变态过程形成精子，包括核染色质浓缩成为精子头部的主要结构；高尔基复合体形成顶体；中心体形成精子尾部的中轴结构：线粒体聚集形成线粒体鞘；多余胞质形成残余体脱落等[6，7】(具体过程见图1)。精子发生是在成年雄(男)性睾丸的生精小管中完成的，这一过程受到多种因素的精密调控[8】，不仅涉及各级生精细胞与支持细胞(Sertoli细胞)的相互作用，而且是众多因子、激素共同参与，协调作用的结果[9，10]。Sertoli细胞的基部紧贴生精小管的基膜，顶部则直达管腔，侧面和腔面有许多不规则凹陷，其内镶嵌着各级生精细胞。相邻Sertoli细胞侧面近基部的胞膜形6 上海交通大学博士学位论文(引自成令忠主编《组织胚胎学》，上海科学技术文献出版社)图1精子发生过程示意图Figure1Schematicdiagramofspermatogenesis成的紧密连接，将生精上皮分成基底室和近腔室两部分，紧密连接是构成血．睾屏障的重要组成部分。基底室位于生精上皮基膜和Sertoli细胞紧密连接之间，内有精原细胞；近腔室位于紧密连接上方，与生精小管管腔相通，内有精母细胞、精子细胞和精子。前细线期和细线期的精母细胞必须穿越紧密连接进入近腔室，才能顺利完成减数分裂及精子细胞的变形过程。Sertoli细胞不仅对生精细胞行使机械支持作用，构成不可渗透的免疫屏障，为精子发生营造适宜的微环境，而且参与生精细胞的迁移和精子的释放，其分泌的蛋白、激素、生长因子以及细胞外基质等，为各级生精细胞提供营养物质，在生精细胞的发育和分化过程中发挥重要作用。此外，Sertoli细胞还含有卵泡刺激素(folliclestimulatinghormone，FSH)受体和雄激素受体，参与、调节激素的代谢。可见Sertoli细胞对精子发生的作用是多方面的，其中任何一个环节受到干扰均有可能导致生精障碍。由于Sertoli细胞与各级生精细胞密切接触，这两类细胞之间的相互作用是精子发生的中枢性调节机制[11，12]。睾丸间质细胞(Leydig细胞)分布于生精小管外的睾丸间质中，其主要作用是分泌雄激素，此激素进入生精小管后，与支持细胞上的雄激素受体以及管腔中7舐霉斟，每鼢 上海交通大学博士学位论文的雄激素结合蛋白相结合，促进精子的发生和成熟。除了生殖细胞与上述体细胞之间的相互作用外，精子发生还受下丘脑．垂体．睾丸轴的调控。一方面下丘脑．垂体调节睾丸的功能，下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(gonadotrophinreleasinghormone，GnRH)刺激垂体分泌FSH和黄体生成素(1uteinizinghormone，LH)，FSH作用于支持细胞，使后者产生一系列物质，调节精子发生过程，是启动精子发生的重要因子。LH*U激Leydig细胞合成分泌的睾酮，作用于支持细胞和肌样细胞上的睾酮受体，促进精子的发生[13，14]。另一方面睾丸分泌的激素又能反馈性地调节下丘脑和垂体的分泌活动，维持睾丸正常的内分泌功能。随着研究手段的进步，人们对于睾丸发育和精子发生的认识不断加深。生精小管上皮的发生是伴随着胚胎发育时PGCs的迁移过程开始的，PGCs在原始支持细胞和管周肌样细胞的作用下形成睾丸索；出生后，睾丸索发育为生精小管，支持细胞增殖，生殖细胞开始分裂；青春期由于GnRH刺激FSH和LH的分泌，从而启动精子发生。然而，人们对于出生后的生殖细胞的发育、成熟以及非啮齿类动物的精子发生及其机制仍知之甚少，缺少合适的研究精子发生的模型是一个主要原因。经过多年的探索，研究者先后运用睾丸组织移植、睾丸细胞移植和生殖细胞的体外培养等技术，开展了大量的研究。由于体外培养体系难以模拟睾丸生精小管的三维立体结构使研究受限，睾丸移植以其能相对完整地保持生精小管的空间结构而受到广泛关注。其中，以睾丸组织移植研究得最多，随着将供体睾丸组织移植入受体睾丸中获得了供体的精子[15]，人们将供体的睾丸组织移植至裸鼠的皮下组织(即异位)同样观察到了完整的精子发生过程【16-21]，从而为精子发生的研究开辟了新途径。与之类似，在睾丸细胞移植方面，供体的SSCs移植至受体的生精小管后，可观察到细胞进一步发育成熟[22，23】。之后，睾丸的细胞移植扩展到更多的细胞类型，并从单一细胞移植发展到了两种、多种细胞共同移植，移植的部位也从睾丸发展到了肾被膜下、裸鼠皮下组织等部位，这些实验均检测到了供体生殖细胞在受体中的发育。令人惊喜的是，在睾丸细胞混合移植的实验中，研究者在异位重构出了生精小管样结构[24．26]，这对于研究精子发生过程中细胞间的相互作用，为更好地探讨精子发生所需的微环境提供了实验依据。 上海交通大学博士学位论文在实验中，我们首先利用小鼠睾丸组织、睾丸细胞的异位移植，验证在裸鼠皮下即异位重构生精小管的可行性，并在此基础上，初步探讨了一种多能干细胞——诱导多能干细胞在异位形成的精子发生微环境中的分化潜能。 上海交通大学博士学位论文第一章新生小鼠睾丸组织异位移植重构生精小管f120世纪50年代，陆续出现了睾丸组织移植的相关报道，但这些研究主要是围绕雄激素替代这一课题而展开的【27】。之后，越来越多的研究者将其应用于类固醇激素合成和精子发生的研究[28，291，并取得了很大进展。Shinohara等[17】将未成熟小鼠和兔的睾丸组织移植于小鼠睾丸内，得到了成熟精子，后者经体外受精而获得了子代。Ohm等[301将新生小鼠睾丸组织移植于裸鼠睾丸内，发现所移植的睾丸组织可进一步发育，且生精功能正常。2002年，Honaramooz等【15]首次将新生小鼠、猪和山羊的睾丸组织移植至去势裸鼠的背部皮下，在移植物中观察到了完整的精子发生过程，并获得了成熟的、功能正常的精子。此后，其他物种如仓鼠，猫，猪，牛，猴等睾丸组织的异位移植陆续获得了成功[15—18，31，32】。综上所述，睾丸组织移植技术除了在拯救濒危动物[33]，为男性癌症患者研究保存生殖细胞，保存生育能力等方面具有应用前景之外[33，34]，也为研究睾丸的功能和生精过程提供了一条新途径。本实验以免疫缺陷动物为受体，研究新生小鼠睾丸组织在异位的生长能力，通过观察移植物的形态学变化，探讨睾丸生长发育以及精子发生所需的微环境。1．1材料与方法1．1．1实验动物新生(1~2d龄)雄性ICR小鼠、BALB／c．nu／nu裸鼠，成年(8w)雄性ICR小鼠，由中国科学院上海实验动物中心提供。1．1．2实验材料手术器械：无菌手术包，含眼科剪、眼科镊、棉球、缝线等。另有75％乙醇棉球。1．1．3主要试剂苏木精、伊红(醇溶)、碱性品红购自国药集团化学试剂有限公司，磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、乙醇、乙醚、甲醛、苦味酸、冰醋酸、硫酸铝钾、高锰酸钾、亚硫酸氢钠等一般化学试剂购自上海化学试剂10 上海交通大学博士学位论文有限公司。1．1．4主要溶液0．01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7．4)：磷酸二氢钾2mM磷酸氢二钠10mM氯化钠137mM氯化钾2．7mMddH20定容至1LBouin’s液：苦味酸饱和水溶液甲醛冰醋酸75ml25ml5mlHasnsen钾矾苏木精：A液：苏木精lg无水乙醇10111lB液：硫酸铝钾20gddH2020gC液：高锰酸钾1gddH2016mlA、B、C液分别溶化后，将A液倒入B液，再加入C液3皿，充分搅拌均匀后加热至沸腾，1rain左右，将容器置于冷水中使其迅速冷却，即可使用。醇溶性伊红：伊红(醇溶)70％～90％乙醇冰醋酸过碘酸溶液：5-10g1000ml10滴 上海交通大学博士学位论文过碘酸ddH2029200ml1N盐酸(按1000ml用量)：盐酸89IIlld(1H20911ml席夫(Schiff)试剂(配制20m1)：量取ddH2020ml，煮沸，将0．1g碱性品红慢慢到入沸水中，边放边搅拌至完全溶解。待温度降至60～70℃时过滤至锥形瓶中，加2ml1N盐酸于瓶中，摇匀。加入亚硫酸氢钠O．2g于瓶中，塞紧瓶口，摇荡至完全溶解，用黑纸将瓶包严，置于阴暗处过夜。次日加100mg活性炭于瓶中，摇匀后迅速过滤于棕色瓶内。保存于4。C冰箱中备用。10％偏重亚硫酸钠：偏重亚硫酸钠ddH20偏重亚硫酸盐溶液：10％偏重亚硫酸钠1N盐酸d(1H20亚硫酸氢盐溶液：10％偏重亚硫酸钠1N盐酸ddH201．1．5主要仪器电子天平超纯水仪石蜡包埋机1g10ml5ml5ml90ml5ml5ml90mlSartoriousGermanyMilliporeUSALeica(EGl160)Germany12 上海交通大学博士学位论文石蜡切片机组织摊片机组织烤片机普通光学显微镜1．1．6实验方法Leica(RM2235)Leica(m1210)Leica(H11220)NikonGermanyJapan1．1．6．1新生小鼠睾丸组织移植①1~2d龄雄性ICR小鼠10只，浸泡于75％乙醇5min，脱颈将其处死。②取出小鼠，于超净台中剖腹，可见睾丸位于膀胱两侧略靠下方处，约小米粒大小，呈半透明状，小心分离与睾丸相连的附睾，将取出的睾丸放入无菌PBS中，洗2次。③尽量将附睾去除干净，剖开睾丸(一只睾丸剖成2～3部分)，放在无菌的PBS中备用。④乙醚麻醉BALB／c。nu／nu裸鼠，75％乙醇消毒其背部皮肤，每只裸鼠背部切开4个约长0．5cm的切口，每个切口植入2~4块睾丸组织，缝合切口。⑤裸鼠去势：将裸鼠睾丸挤入阴囊，穿线法结扎睾丸，将睾丸及周围的阴囊皮肤一起剪除，修剪断面残端，术中小心止血，手术完毕裸鼠放入笼内常规饲养。1．1．6．2移植物的观察与取材术后密切观察裸鼠活动状况及其手术切口愈合情况，观察、记录移植物生长情况，并于移植术后4w、5W、6W、7w、8W、10W取材(每个时间点均在不同受体上取材)。取下的移植物及正常小鼠的睾丸放入Bouin’S液固定24h，流水冲洗10h，常规梯度脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。另取2d龄雄性ICR小鼠、成年雄性ICR小鼠的睾丸组织行石蜡包埋、制备切片作为对照。1．1．6．3标本制备石蜡切片：连续切片，厚5I．u'n。1．1．6．4切片染色1．1．6．4．1HE染色二甲苯I二甲苯II10min10min 上海交通大学博士学位论文100％乙醇I10min100％乙醇II10min95％乙醇5min85％乙醇5min75％乙醇5minddH20冲洗1min苏木精5rain自来水冲洗盐酸酒精分化10．15s自来水洗10minddH20洗1min95％乙醇I5min伊红5min95％乙醇II10rain95％乙醇Ⅲ10min100％乙醇I10min100％乙醇II10min二甲苯I10min二甲苯II10min中性树胶封片，镜下观察。1．1．6．4．2过碘酸席夫染色(Periodicacid．Schiffstain，PAS染色)①切片脱蜡至水；②过碘酸溶液5min；③ddH20充分漂洗；④希夫试剂15min(室温)；⑤亚硫酸氢盐溶液3rain；⑥流水冲5min，ddH20漂洗lmin；⑦Hasnsen苏木精复染3mira⑧流水冲洗10min，ddH20漂洗；⑨95％乙醇、100％7,醇依次脱水；14 上海交通大学博士学位论文⑩二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。1．1．6．5移植物生精小管中各种细胞的计数与统计每个时间点取5个不同移植物的组织切片，于高倍镜下随机取5个视野，对视野中生精小管的各级生精细胞及Sertoli细胞进行计数，计算各取材时间点各种细胞所占的百分比。以正常成年小鼠睾丸组织作为对照。1．2实验结果1．2．1移植物的生长情况移植的40个组织块中，39个观察到了睾丸组织的进一步生长，组织块成活率为97．5％。移植后的前2W，移植物生长较缓慢，之后生长迅速，至第4W时，移植物呈半球状隆起，可用肉眼分辨出长入移植物的新生血管，5～8w时移植物体积进一步增大，8W后，移植物生长速度减慢，甚至停止。1．2．2liE染色1)供体组织1～2d龄小鼠睾丸：生精小管呈索状、管状，大多出现管腔，但较小。生精上皮由1~2层前精原细胞和支持细胞构成，前精原细胞大而圆，胞质嗜酸性，胞核呈圆形或椭圆形，靠近管腔或者贴基膜排列；支持细胞近基膜分布，胞体轮廓不清楚，核为三角形或不规则形，体积比前精原细胞小(图2A)。2)对照正常成年小鼠睾丸：可见许多生精小管的断面。生精小管由生精上皮构成，后者由Sertoli细胞和多层生精细胞组成，排列有序，上皮基膜外侧有肌样细胞。从生精小管的基膜至管腔依次可见精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子，在不同断面可观察到不同增殖时期的初级精母细胞。精子近管腔，其头部内有染色质高度浓缩的细胞核，核的前三分之二有顶体覆盖。支持细胞镶嵌于各级生精细胞的胞体之间，形态不规则，从基膜一直伸达管腔，胞质染色浅；核呈三角形或不规则形，染色浅，核仁明显。在生精小管的间质中，可见Leydig细胞，细胞圆形或多边形，核圆居中，胞质嗜酸性(图2B)。3)移植物4w：移植的睾丸组织可见多个生精小管的断面，管腔增大，生精小管多由1～3层细胞构成，精原细胞和Sertoli细胞贴基膜排列，初级精母细胞胞核明显，靠近管腔，可观察到不同增殖时期的初级精母细胞。支持细胞的基底部位于基膜 上海交通大学博士学位论文上，其形态不规则，胞体从基膜一直伸达管腔，核呈三角形或不规则形，染色浅，核仁明显。生精小管基膜外有肌样细胞，其胞核呈长梭形。小管的的问质中可见胞质嗜酸性的Leydig细胞(图2C)。5w：移植物生精小管的生精细胞逐渐有序排列，从基膜至管腔依次可见精原细胞、粗线期精母细胞和极少量精子细胞。Sertoli细胞的基底部紧贴基膜，胞体镶嵌在各级生精细胞的胞体之间，生精小管的间质中可见Leydig细胞(图2D)。6w：移植物生精小管的细胞层次增多，排列有序。从基膜至管腔依次可见精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子，Sertoli细胞镶嵌于各级生精细胞的胞体之间，生精小管的间质中可见Leydig细胞(图2E)。7w：移植物生精小管的细胞层次增多，排列有序。与正常成年小鼠睾丸组织相似(图2F)。8W：移植物的结构与正常成年小鼠睾丸组织相似(图2G)。10w：个别生精小管出现退化，部分生精细胞游离至管腔中(图2H)。此外，在各移植物中几乎没有观察到仅含Sertoli细胞的生精小管。1．2．3PAS染色1)移植物4w：生精小管多由1～3层细胞构成，小管的基膜染为紫红色，其外可见多个梭形肌样细胞。精原细胞和Sertoli细胞大都贴基膜排列，初级精母细胞胞核明显，靠近管腔，可观察到不同增殖时期的初级精母细胞。小管的间质中可见Leydig细胞，细胞外基质呈紫红色(图4A)。5W：生精小管的细胞层次增多。小管的基膜染为紫红色，其外可见多个梭形肌样细胞，管腔内可见支持细胞、精原细胞以及初级精母细胞。小管的间质中可见Leydig细胞，细胞外基质呈紫红色(图4B)。6w：生精小管的细胞层次增多，排列较有序。从基膜至管腔依次可见精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、圆形精子细胞，圆形精子细胞近核膜处出现紫红色的顶体粒和圆形或椭圆形顶体泡，变形的精子的胞质呈紫红色，Sertoli细胞镶嵌于各级生精细胞的胞体之间，生精小管的间质中可见Leydig细胞，细胞外基质呈紫红色(图4C)。7W：与第6w时相似(图4D)。8w：生精小管的细胞更加有序。从基膜至管腔依次可见精原细胞、初级精16 上海交通大学博士学位论文母细胞、次级精母细胞、圆形精子细胞以及精子，圆形精子细胞近核膜处可见圆形或椭圆形染为紫红色的顶体泡；变形中的精子呈宽梭形，胞核明显，胞质、残余体染为紫红色。成熟精子近管腔，胞核较小。Sertoli细胞镶嵌在各级生精细胞的胞体之间，生精小管的间质中可见Leydig细胞，细胞外基质呈紫红色(图4E)。2)对照正常成年小鼠睾丸：可见多个生精小管的断面，小管基膜染成紫红色。生精上皮的细胞排列有序，从生精小管的基膜至管腔依次可见多种生精细胞：精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子。圆形精子细胞近核膜处出现紫红色的顶体粒和圆形或椭圆形顶体泡，变形中的圆形精子形态不规则，呈宽梭形或长梭形，其胞质及残余体呈紫红色。精子呈梭形，头部内有着色深的细胞核。Sertoli细胞镶嵌于各级生精细胞的胞体之间，形态不规则，从基膜一直伸达管腔，核呈三角形或不规则形，染色浅，核仁明显。生精小管的问质中可见Leydig细胞，细胞外基质呈紫红色(图4F)。1．2．4移植物生精小管中各种细胞的计数与统计睾丸组织移植后第4、5W移植物生精小管中仅有精原细胞、精母细胞和Sertoli细胞；第6、7、8w时，移植物生精小管中的细胞构成及其百分比与正常成年小鼠睾丸组织的相似(图3)。 上海交通大学博士学位论文18 一圭塑銮望奎堂苎主兰垡丝奎一——图2睾丸组织移植物、供体及正常成年小鼠睾丸组织脏染色(标尺：20pm)Figure2Histologicalappearanceofdonor，graftandcontroltissue(HematoxylinandEosinstained,HE)(Scalebars=20“m)A．1～2d龄小鼠睾丸组织；B．正常成年小鼠睾丸组织；C．睾丸组织移植后4w；D．睾丸组织移植后5w；E．睾丸组织移植后6w；F．睾丸组织移植后7w；G．睾丸组织移植后8w；H．睾丸组织移植后10W。日示Sertoli细胞，_示精原细胞，日示初级精母细胞，一示精子细胞，——◆示精子，≮?示睾丸间质细胞100％80％60％40％20％0％§套§心《萝Timepost-grafting(weeks)謦Spcrmaspto—cytc砒sSpcrmatogonia迅／gonocytesSCsl口l■l目图3睾丸组织移植各时间点的移植物及正常成年小鼠睾丸组织生精小管中的细胞百分比Figure3PercentagesofdifferentcelltypepresentineachcordortubuleofgraftandcontroltissueSCs：支持细胞；Spermatogonia／gonocytes：精原细胞／前精原细胞；Roundspermatids：圆形精子细胞；Elongatedspermatids：长形精子细胞。19∞oTnonl∞=20H苫一吕o∞ogII—o口扫一一oD_IIo．I∞口一它qo∞o比-口IIQD-o厶 上海交通大学博士学位论文20 上海交通大学博士学位论文21 上海交通大学博士学位论文图4睾丸组织移植物、供体及正常成年小鼠睾丸组织PAS染色(标尺：20岫)Figure4Histologicalappearanceofdonor,graftandcontroltissue(PeriodicAcid-Schiffstained，PAS)(Scalebars=200au)A．睾丸组织移植后4w；B．睾丸组织移植后5w；c．睾丸组织移植后6w；D．睾丸组织移植后7w；E．睾丸组织移植后8w；F．正常成年小鼠睾丸组织。日示Sertoli细胞，■—◆示精原细胞，[二今示初级精母细胞，_示精子细胞的顶体粒或顶体泡，——◆示精子1．3讨论2002年以来，将睾丸组织移植于裸鼠皮下，移植物进一步生长、发育并获得精子的报道不断出现，在这些研究中，供体的种属已由小鼠、大鼠【15，31]等小动物发展到了大动物，如兔【17]、牛[16]、羊【19】、猪【35]、猴【15】、马[32]等，供体的年龄也涉及了胚胎时期、出生后不久、青春期、成年等几个时间段。上述年龄阶段，以新生和成年个体的睾丸组织移植研究的最多。StaRer等[36]将胎鼠、新生和成年大鼠的睾丸组织种植于同种成年鼠的肾被膜下，前两种移植物的生长发育和结构良好，而成年大鼠的睾丸组织作为供体进行移植则被排斥，说明胚胎及新生鼠的睾丸组织具有较低的免疫原性。Schlatt、Honaramooz等【15，21，37]的研究结果与之相似，他们比较了小鼠新生睾丸和成年睾丸作为供体的移植情况，发现成年睾丸组织移植物的精子发生难以维持，而未成熟睾丸组织移植物的发育明显优于前者，可在异位完成精子发生过程，并产生成熟的精子。成年供体的移植物不仅成活率低，而且易发生退化[38，39]。未成熟的睾丸组织在移植之后，无论在移植物重量、血管形成上，还是在形成的生精小管的数量及直径等方面都比成年供体组织要好，可能与成年供体的睾丸组织不适应移植后短暂性缺血有关【15，39，40]，也可能是由于其血管形成能力欠缺造成的【41]。未成熟睾丸比成年的睾丸能更好地应对缺血，更易产生血管【15，41]。另外，成年睾丸组织中的Sertoli细胞已经发育成熟，丧失了增殖、分裂能力，不能很好地支持生殖细胞的发育，从而使精子发生停滞在某一阶段[15，40】。基于这一点，实验中我们选用出生后1~2d的雄性ICRd、鼠的睾丸组织作为供体，由于它未发育成熟，具有较低的免疫原性，移植之后在受体中存活较好，并可正常发育，与Dobrinski、Honaramooz、Schlatt等人的报道一致[15，21，37]。在 上海交通大学博士学位论文受体的选择上，常用的免疫缺陷小鼠为BALB／c．nu／nu和SCID(severecombinedimmtmodefieient，SCID)，目前尚无对二者作为受体的系统的比较，但就移植物的存活来看无明显差别【32，42]。由于BALB／c．nu／nu无毛发，以它作为受体，术后移植物生长情况的观察更方便，且有利于伤口的愈合和控制感染[41]。与其他组织、器官的移植一样，移植物要长期存活，需要受体提供足够的营养。已知内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)具有刺激血管内皮细胞的有丝分裂和血管发生的功能，用VEGF在移植前刺激作为供体的睾丸组织，发现VEGF能增加移植物重量，提高生精小管中长形精子的百分率[43]，可见血管对移植物的生长影响很大。移植部位既要求血管丰富，又要求能够提供一个不阻碍移植物生长发育的较大空间。由于啮齿类动物皮肤较松，易于剥离，并且较其他移植部位的操作更简单，可以很快建立有效的血液循环，因此我们选择裸鼠背部皮下作为移植部位。将新生小鼠的睾丸组织移植至裸鼠皮下，由于该组织块结构相对完整，移植物很快被纤维膜包裹，可透过裸鼠(受体)的皮肤观察到长入移植物的多条血管，说明移植物与受体建立了良好的血供，高达97．5％的成功率也证明了这一点。出生后1~2d小鼠睾丸的生精小管中仅有前精原细胞和SertoH细胞，随着移植时间的延长，移植的组织体积逐渐增大，前精原细胞迁移至基膜，一部分恢复有丝分裂成为精原细胞，后者进一步增殖、分化。HE、PAS染色观察发现，移植物的生精小管管腔逐渐扩大，细胞也由之前的一层变为两层、多层，排列逐渐有序。睾丸移植后第4W，生精小管的管腔增大，提示生殖细胞发育和Sertoli细胞增殖，也被组织学检测所证实[44]。至移植后6W，从基膜至管腔可依次观察到精原细胞、初级精母细胞、精子细胞和精子，次级精母细胞因在出现后立即进入第二次减数分裂而很少在切片中观察到。Sertoli细胞的胞体由基膜直达管腔，胞体与各级生精细胞的胞体镶嵌在一起，胞核靠近基膜。此时，移植物的结构与正常生精小管的结构非常类似。移植后第8w时，生精小管的结构与第6w时无明显差异，从而为移植物发育研究过程中取材时机的选取提供了重要信息。但第10W时，生精小管出现不同程度的退化，可能由于异位移植的睾丸组织缺乏与生精小管相连的输出小管，导致管内液体积聚，进而造成了对生精小管的损伤。另有报道，移植物的基因表达情况与正常睾丸组织相似，且生精周期与正常精子发生一致[45]，进一步证明了异位移植睾丸组织进行研究的可行性。 上海交通大学博士学位论文精子的顶体出现在精子形成阶段，是由精子细胞核附近的高尔基复合体形成的，呈囊泡状或半球形粘附于细胞核前端表面，因其内富含糖蛋白，PAS阳性，呈紫红色，结合苏木精复染可更清晰地分辨各级生精细胞核的结构。因此，顶体系统的出现可作为生精细胞发育的一个重要指标。实验中我们发现，顶体粒、顶体泡于移植后第5W时出现，6～8W时均可观察到，以顶体泡和半球形的顶体泡居多，同时可见即将脱离或已经脱离的被染为紫红色的残余体存在，与正常成年睾丸的染色结果相似，说明生精细胞的进一步成熟。精子发生是个复杂的过程，受下丘脑．垂体．睾丸轴的精密调控。一方面下丘脑．垂体调节睾丸的功能，另一方面睾丸分泌的激素又能反馈性调节下丘脑和垂体的分泌活动。三者在功能上密切联系，互相影响。实验中，我们将裸鼠去势以去除受体自身激素的干扰。去势后，受体FSH的升高诱发Sertoli细胞增殖，之后，移植的睾丸组织与受体建立新的下丘脑．垂体．睾丸轴，裸鼠下丘脑分泌的LH促进Leydig细胞的成熟及其后的睾酮分泌，同时，Sertoli细胞的支持作用为生殖细胞的生长、分化提供了合适的微环境，使供体在受体内分泌的支持下完成生殖细胞的发育。有研究显示，未经去势的受体不能支持供体睾丸组织的发育[32】。但也有相反的例子，异位移植的兔等动物的睾丸组织在未去势的小鼠中形成了精子【17，46，47]，提示可能存在着种属差异。综上所述，新生小鼠的睾丸组织可以在去势裸鼠的皮下组织即异体、异位继续生长发育，启动并完成精子发生，裸鼠皮下组织可以提供良好的血供和精子发生的微环境。睾丸组织移植简单易行，成功率高，可以作为研究生精细胞发育和精子发生调控机制的动物模型，为体外形成精子提供了新途径。24 上海交通大学博士学位论文第二章新生小鼠睾丸细胞异位移植重构生精小管随着器官移植技术的不断发展，睾丸移植经历了器官水平、组织水平、细胞水平移植三个阶段。在细胞移植中，研究者通常将供体的生殖细胞移植入受体的睾丸中，研究供体细胞的归巢、定居与发育情况，移植的细胞涵盖TSSCs、精原细胞等生殖细胞以及Sertoli细胞、睾丸Leydig细胞等，但多为某种细胞单独移植。哺乳动物的精子发生是SSCs定向分化的过程[48．50]。由于SSCs和其他干细胞一样，具有自我更新和增殖能力，是精子的前体细胞，关于这一细胞移植的报道比较多【20，51．53]。研究发现，供体来源的精子发生主要依赖于移植的SSCs的数目以及受体提供的微环境[22，23]，SSCs睾丸内移植在多种动物获得了成功，这一技术可以保存供体的生育力[54．62]。然而睾丸组织中的SSCs数量极少且不易分离，大动物的SSCs移植实验未能观察到供体完整的精子发生过程，从而限制了该技术的应用【63．65】。与此同时，人们积极探索着其他研究途径，将所分离的供体的睾丸细胞(不仅仅限于SSCs)移植入受体睾丸，在小鼠和大鼠、羊和小鼠之间的生殖细胞移植的实验中发现，受体睾丸可以支持供体生殖细胞的精子发生，并产生精子【61，66．68]。然而，其他物种如兔、狗、猴以及人的生殖细胞移植至小鼠睾丸，发现供体SSCs可以增殖，但未发现供体完整的精子发生过程，提示小鼠睾丸可能不能提供与其种属关系较远的供体的生殖细胞发育所需的微环境[4，52，53，63，69-71]，但这些实验为精子发生的研究提供了新思路，为长期保存雄(男)性的生育力提供了实验依据。精子发生这一复杂的细胞分化过程是在生精小管中完成的，Sertoli细胞作为生精小管内唯一与生精细胞接触的体细胞，以其独特的结构和功能为精子发生提供适宜的微环境。未成熟的Sertoli细胞可在异位(如肾、皮肤等处)形成索状或管状结构，由于此细胞具有免疫豁免性而可在自体异位和异体中长期存活[72-75]。近年来，人们将生精细胞及其周围体细胞共同移植，以期维持生精细胞生长发育所需的微环境，探讨生殖细胞的异位生长能力。Dufour等【76]研究发现，大 上海交通大学博士学位论文鼠睾丸细胞移植至肾被膜下，形成了类生精小管样结构，但是否形成了功能性微环境，生殖细胞能否定植于此并启动精子发生尚有待进一步研究【24】。12．5dpc的PGCs与生殖腺体细胞共移植至成年小鼠的肾被膜下，4w后形成睾丸、卵巢样结构，所形成的圆形精子经体外受精可以产生子代，卵泡结构经体外成熟同样具有受精能力【77】。Honaramooz等[25]将新生小鼠睾丸细胞(包括生殖细胞和Sertoli细胞)与绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)标记的生殖干细胞混合后进行移植，发育形成的圆形精子经体外受精获得带有GFP的小鼠，说明重构形成的组织及微环境能够支持精子发生。那么，睾丸的体细胞能否在裸鼠的皮下组织形成生殖细胞发育、分化的微环境?后者能否支持生殖细胞的归巢和进一步发育呢?我们以新生ICRd"鼠的睾丸细胞进行细胞移植，探讨其在裸鼠皮下即异位重构生精小管的能力，希望为研究精子发生及生精小管各组成细胞之间的相互作用打下一定的基础。2．1材料与方法2．1．1实验动物5～7d龄雄性ICR小鼠、BALB／c．nu／nu裸鼠，由中国科学院上海实验动物中心提供。2．1．2实验材料手术器械：无菌手术包，含眼科剪、眼科镊、棉球等。血细胞计数板、75％乙醇棉球等。细胞培养皿(Coming公司，USA)；0．22gm、0．44lxm针孔过滤器(Millipore公司，USA)；15ml、50ml离心管(Coming公司，USA)等。2．1．3主要试剂DPBSHycloneUSADMEM／F12HycloneUSAFBSGibcoUSA青／链霉素溶液(Penicillin／Streptomycinsolution，P／S)HycloneUSA0．05％胰酶(含EDTA)(Trypsin-EDTA)GibcoUSAII型胶原酶(CollagenaseII)InvitrogenUSA透明质酸酶SigmaUSAExtracellularMatrixProteins：GrowthFactorBDUSA 上海交通大学博士学位论文ReducedMatrixBDMatrigelTMHistostain-Pluskit(LAB-SAdetectionsystem)InvitrogenUSA兔抗mouseVASAhomolog(MVH)AbcamUSA2．1．4主要溶液睾丸细胞培养液：FBS10％P／S0．5％DMEM／F12定容2．1．5主要仪器超净工作台SANYOJapan离心机EppendorfGermany水浴震荡仪PrecisionUSA倒置相差显微镜NikonJapan2．1．6实验方法2．1．6．1睾丸提取液的制备5～7d龄雄性ICR小鼠，75％乙醇浸泡5min，脱颈将其处死。无菌条件下剖腹取出睾丸，分离干净周围的脂肪组织，将其置于灭菌的匀浆器中匀浆5～10min，加入DMEM／F12(1-2mY睾丸)，将匀浆后所得的液体移入离心管，12000rpm，离心10min，收集上清。所剩沉淀用3～5IIll的DMEM／F12再次匀浆、离心、收集上清。两次得到的上清液依次经0．44¨m、0．22}xm的针孔过滤器过滤，4"C保存备用(匀浆、过滤均在冰上进行)。2．1．6．2新生小鼠睾丸细胞的制备①5～7d龄雄性ICR小鼠，浸泡于75％乙醇5rain，脱颈处死。②取出小鼠，无菌条件下剖腹取出睾丸，尽量去除与之相连的附睾，PBS洗1次。③去除睾丸白膜，睾丸组织放入1．5“的EP管中，剪碎。④剪碎的组织移入5“的溶有II型胶原酶(1．5mg／m1)的DMEM中，37。C，50rpm震荡，消化20min。⑤1000rpm、离心5min，去除上清，加入溶有II型胶原酶(1．5mg／m1)、透明质酸酶(1．5mg／m1)的Trypsin中，37"C，120-150rpm震荡，消化20-30min，27 上海交通大学博士学位论文加入两倍体积的睾丸细胞培养液终止消化。⑥1000rpm、离心5min，去除上清，睾丸细胞培养液重悬，细胞计数；⑦细胞悬液1000rpm、离心5min，去上清，以睾丸提取液重悬，加入等体积的MGM，混匀。细胞终浓度约为10—30x106／ml(MGM加入后的重悬、悬液的暂时保存均在冰上进行)。2．1．6．3新生小鼠皋丸细胞移植乙醚麻醉6～8W龄雄性BALB／c．nu／nu裸鼠，用26G套管针吸取细胞悬液，将其注射于裸鼠背部皮下组织，每只注射裸鼠4-6个点，每点注射约50斗1的细胞悬液，移植完成后裸鼠行手术去势。术后观察裸鼠的苏醒情况及行为。2．1．6．4移植物的观察与取材术后观察、记录移植物生长情况，于移植后4W、5W、6W、8w、10W取材(每个时间点均在不同受体上取材)。取下的移植物及正常小鼠睾丸组织放入Bouin’S液固定24h，流水冲洗10h，常规梯度脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，切片。2．1．6．5HE染色(见第一章)2．1．6．6PAS染色(见第一章)2．1．6．7免疫组织化学染色①切片入3％H202．甲醇液10min，室温。②PBS洗5minx3次。③滴加10％山羊血清封闭液孵育10rnin。④弃去液体，滴加兔抗MVH(1：50)，4。C过夜。⑤PBS洗5minX3次。⑥加一滴抗兔生物素化二抗，孵育10min。⑦PBS洗5minx3次。⑧加一滴链亲和素过氧化物酶，孵育10min。⑨PBS洗5minX3次。⑩滴加DAB显色液，室温显色5～10min(镜下控制显色程度)。苏木精复染，常规脱水、透明，中性树胶封片、镜检。阴性对照：用0．01MPBS替代一抗，其它步骤相同。2．2实验结果 上海交通大学博士学位论文2．2．1移植物的生长情况细胞悬液在注射后形成一个球形隆起，移植后第2d，高起处变平，2w内再次形成隆起，移植物体积逐渐变大。白第4W可见血管长入移植物，第8W时移植物高约3～5111111，直径约6~8mm，之后生长缓慢。进行睾丸细胞移植所注射的52个包，于各时间点共获得44个移植物，成活率为84．6％。2．2．2移植物HE染色在不同取材时间点的移植物中均观察到了生精小管样结构，这些结构有完整的基膜，基膜外有肌样细胞。在这些结构中，观察到了生殖细胞与Sertoli细胞共同构成的管状结构和唯Sertoli细胞的管。4W：移植物中可见生精小管样结构，由1～3层精原细胞和Sertoli细胞构成，几乎无管腔(图5A)。5W：构成类生精小管结构的细胞排列逐渐有序，出现管腔，Sertoli细胞多贴基膜排列，精原细胞位于近基膜处或靠近管腔(图5B)。6w：类生精小管结构与移植后第5w时相似(图5C)。8w：类生精小管结构中的细胞排列有序，Sertoli细胞贴基膜排列，精原细胞位于近基膜处，可见分裂中的粗线期精母细胞(图5D)。2．2．3移植物PAS染色精子的顶体是由精子细胞核附近的高尔基复合体形成的，呈囊泡状或半球形粘附于细胞核前端表面，因其内富含糖蛋白，PAS染色呈阳性，被染为紫红色。为进一步检测移植物中生殖细胞的发育情况，我们对移植后10w的移植物进行了PAS染色，发现类生精小管结构中的细胞排列有序，Sertoli细胞、精原细胞贴基膜排列，可见分裂中的粗线期精母细胞，未观察到紫红色的顶体，仅小管基膜呈紫红色(图5E)。2．2．4移植物免疫组织化学染色睾丸细胞移植后第4W时，观察到生精小管样结构中有MV矿的细胞(图6)。 上海交通大学博士学位论文图5睾丸细胞移植物形态学观察(标尺：20lain)Figure5Histologicalappearanceoftissueformedaftertransplantationofisolatedtesticularcellstohostmice(A-D：HEstained；E：PASstained)(Scalebars220lain)A．D：HE染色；E：PAS染色。A．睾丸细胞移植后4w；B．睾丸细胞移植后5w；C．睾丸细胞移植后6w；D．睾丸细胞移植后8w；E．睾丸细胞移植后10w日示Sertoli细胞，_示精原细胞，日示粗线期精母细胞30 上海交通大学博士学位论文图6睾丸细胞移植物IVlVH免疫组织化学染色(A)，B：对照(苏木精复染，标尺：20Ixrn)Figure6Immunohistochemicalidentificationofgermcellsaftertransplantationofisolatedtesticularcellstohostmice(A)，antibodyusedwasagainstMVH；B．contr01．(Hematoxylincounterstained,Scalebars220Ⅲ【n)日示Sertoli细胞，_示MVH+的精母细胞2．3讨论目前，保存雄(男)性生育力的途径包括睾丸组织移植、睾丸细胞移植和睾丸组织细胞的体外培养等【33，78]。已经证明，各级生精细胞的空间构成对于生殖细胞的成熟及其调节至关重要，睾丸组织移植因能保持生精上皮的完整性而获得成功，而常规培养很难模拟睾丸发育、精子发生所需的空间结构，可能对生殖细胞的发育产生负面影响，例如，生殖细胞在减数分裂时需要被支持细胞包围[79】，这在培养中很难实现。1994年，Brinster等[23]发表了第一篇SSCs移植的文章，研究者以LacZ基因为报告基因，通过显微注射技术将正常小鼠的SSCs移植入白消安处理的和存在遗传缺陷的小鼠的睾丸中，SSCs在受者体内实现了定植、增殖和分化，并形成了成熟精子，LacZ基因传给了子代。之后，睾丸细胞移植的实验逐步开展，并大大扩大了研究对象，成为研究精子发生的新方法[51，78，80]新生小鼠的睾丸中仅有精原(干)细胞和Sertoli细胞，与发育成熟的小鼠睾丸相比，有更多的干细胞[81，82]，且细胞的活力好、存活率高[83]。实验中，我们选用出生5～7d龄小鼠作为移植供体，供体睾丸中含有精原细胞(包含SSCs)、 上海交通大学博士学位论文Sertoli细胞、肌样细胞和睾丸Leydig细胞，经两步法消化[52，84]获得睾丸单细胞悬液，悬液中含有上述多种细胞类型。据GasseiK等[52】报道，培养的7d龄CDl大鼠的睾丸混合细胞移植入裸鼠皮下组织后，移植物与受体建立了血供，观察到了索状的生精小管样结构，此结构中不仅有基膜和管腔，在小管之间还有间质细胞。我们的结果与之类似，移植物在最初的2w生长缓慢，之后形成肉眼可见的半球状隆起，透过裸鼠皮肤可见新生的血管，说明供体与受体建立了血供，从而为移植物的生长发育提供物质保证。移植物中有多个管状结构，管外有基膜。虽然这些管的形态不太规则，不是所有的管中都含有生殖细胞，但由于Sertoli细胞具有极性，可见此种细胞的胞核较规则地沿基膜分布，同时观察至lJSertoli细胞常聚集生长，呈索状、团状。正常发育过程中，前精原细胞在个体出生后会迁移至生精小管的基膜，逐渐分化为终末细胞[54]。这一过程中，Sertoli细胞与前精原细胞相互识别，营养支持和调节其分化。随着时间的延长，移植物中的精原(干)细胞逐渐向基膜靠近，它需要与基膜接触，被支持细胞包裹才能开始增殖、分化，因此，这是生殖细胞在异位发育的第一步。精子发生是在睾丸的生精小管中进行的，涉及多种细胞的迁移、增殖、分化，以及细胞之间的相互作用。小管生精上皮中的生殖细胞和Sertoli细胞以其独特的空间位置和相互作用，维持着生殖细胞的发育。Sertoli细胞的底部位于生精小管的基膜上，顶部则直达管腔，侧面和腔面有许多凹陷，其内镶嵌着各级生精细胞，它不仅行使支持作用，还担负着合成、分泌雄激素结合蛋白、转铁蛋白、激素等营养物质的功能，为精子发生营造适宜的微环境，对生殖细胞的发育、分化发挥着重要作用[3，85]。另外，生精小管有个独特的、支持多层细胞的基膜结构，基膜由肌样细胞、支持细胞协同分泌形成，同样对精子发生发挥着重要作用。已知基膜和细胞外基质如层粘连蛋白、巢蛋白、Ⅳ胶原等对Sertoli细胞极性及生精索的形成非常重要[86．88]，它们可促进Sertoli细胞增殖和生殖细胞分化，因此移植时我们充分考虑了生殖细胞发育所需的微环境。由于基质胶的低黏性，用它作为细胞移植时的载体，联合睾丸提取液与睾丸细胞共移植至裸鼠皮下，使移植的细胞在作为支架的基质胶上迁移、生长【89．91]。结果发现，索状结构逐渐变为管状，并出现管腔，管腔的出现说明生殖细胞的进一步发育。为确定管中是否存在所移植的生殖细胞，我们应用免疫组织化学染色进行检测，结果显示，移植后第4w时检测到了MVH的表达，这一蛋白在正常睾丸组织的精原细胞、精母细32 上海交通大学博士学位论文胞和精子细胞中持续表达，是生殖细胞特异性标志物[92】。之后，精原细胞逐渐发育为精母细胞，可在多个小管样结构中观察到多个粗线期精母细胞。但在移植后第10w，PAS染色未观察到精子细胞和精子，说明生殖细胞未能进一步发育成熟，推测与生精细胞增殖能力相对欠缺有关。这一结果与Dobrinsk等【191在新生羊睾丸细胞的异位移植实验中观察到的结果相似。而在另一项研究中，Honaramooz等[26]将新生猪的睾丸细胞混合移植入裸鼠皮下，细胞能重构形成生精小管，在移植后的30w时完成了精子发生，产生了精子。与睾丸组织移植相比，移植的睾丸混合细胞需要定植、重构，细胞的增殖分化可能需要更长的时间，我们的实验结果也许与观察的时间过短有关。目前，重组生精小管的机制尚不明确，在移植的细胞中，SSCs具有自我更新和增殖能力，Sertoli细胞也具有较高的增殖能力，我们认为生精小管的重塑与细胞的增殖潜能有关。另一个重要因素则是神经和血管的形成，细胞在异位生长、被纤维膜包裹后，可以与受体建立血供，支持移植物的生长发育，并在一定程度上营造精子发生的微环境。尽管我们尽可能地在异位营造睾丸的微环境，但移植的效率不高，可能与移植细胞的数量有关，移植的细胞越多越容易形成含有生殖细胞的小管，因此可以考虑在移植前富集生殖细胞以提高成功率。我们通过研究证实，未成熟睾丸中的细胞具有迁移和重构能力，可自行构成生精小管样结构。睾丸细胞异位移植的研究可以用于阐明精子发生中各种细胞之间的关系，为精子发生的分子机制研究以及如何保持生育能力提供实验依据，在此基础上探讨引导生殖细胞和体细胞聚集的信号通路有利于加深对睾丸发生、发育的认识，具有较高的理论意义和价值。尽管睾丸细胞移植成功的例子不多，但已有将人的生殖细胞移植至癌症患者的报道[40，93]。相信这项研究可为人类不育症的治疗提供新方法，具有潜在的应用前景。 上海交通大学博士学位论文第三章iPS细胞在异位重构组织中向生殖细胞分化我们通过睾丸组织移植和睾丸细胞移植的实验证明了睾丸组织在异位的生长发育能力，新生小鼠的精原(干)细胞在移植至裸鼠皮下组织后，可启动精子发生，进入减数分裂，说明在异位营造类似睾丸内微环境的可行性。在前两部分的实验基础上，我们将带有增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)一标记的诱导多能性干细胞(inducedplurigotentstemcells，iPS细胞)与新生小鼠的睾丸细胞进行混合移植，观察iPS细胞在上述环境中的定植及其发育、分化情况。3．1材料与方法3．1．1实验动物(同第二章)3．1．2实验材料(如下，余同第二章，iPS细胞相关信息见第二部分)AlexaFluro标记羊抗兔IgGInvitrogenUSA4’，6·diamidino·2-phenylindole(DAPI)DojindoJapan3．1．3主要试剂和溶液(同第二章)(iPS细胞常规培养用液见第二部分)3．1．4主要仪器(同第二章)(iPS细胞常规培养所用仪器见第二部分)3．1．5实验方法3．1．5．1睾丸提取液、新生小鼠睾丸细胞制备(同第二章)(iPS细胞常规培养见第二部分)3．1．5．2移植用细胞悬液的制备iPS细胞消化后静置30~45min以去除饲养层细胞，收集悬浮细胞，1000rpm、离心5min，iPS细胞培养液重悬，计数。新生小鼠睾丸细胞与iPS细胞按照1：5-10的比例混合，以睾丸提取液重悬，加入等体积的MGM，备用，细胞终浓度约为20～50×106／ml(MGM]JN入后的重悬、悬液的暂时保存均在冰上进行)。3．1．5．3细胞移植步骤(同第二章)3．1．5．4移植物观察、取材术后密切观察裸鼠活动状况，异氟烷麻醉裸鼠，利用动物活体可见光成像系统(IVISSpectrum)观察移植物的生长情况，于移植后4W、6w、8W时拍照。气4 上海交通大学博士学位论文移植物于术后4W、6w、8W、10W取材(每个时间点均在不同受体上取材)。取下的移植物一部分放入Bouin’s液固定24h，制备石蜡切片，另一部分于液氮中速冻，冻于．80"C，制备冰冻切片。3．1．5．5冰冻切片的制备各移植物从-800C取出后，OCT组织包埋剂包埋，冰冻切片机切片(厚10㈣，将切片裱于涂有APES的载玻片上，自然风干后(约10min)储存于--800C冰箱。实验前将切片取出，冷风机吹干，4％多聚甲醛固定15min，PBS洗切片5minX3次，行免疫荧光染色。3．1．5．6免疫荧光染色①切片在PBS液中浸泡10rain。②牛血清白蛋白(BSA)室温封闭lh。③弃去液体，滴加兔抗MVH(1：50)，4。C孵育过夜。④PBS洗5min×3次。⑤滴加AlexaFluro标记羊抗兔IgG，1：200，37"C孵育1h。⑥PBS洗5minx3次。⑦DAPI(1：200)染核10rain。⑧PBS洗5minx3次。⑨甘油PBS封片。⑩激光共聚焦显微镜观察并扫描成像。阴性对照：用0．01MPBS替代一抗，其它步骤相同。3．2实验结果3．2．1移植物的生长情况睾丸细胞与iPS细胞混合移植4W后，绝大多数移植物的体积增大很快，少数生长较缓慢，动物活体可见光成像系统记录包块大小及荧光强度(图7A、B、C)。3．2．2移植物形态学观察HE染色显示细胞混合移植后形成畸胎瘤(图8A、B、C)，极个别的移植物可观察到类似生精小管的结构(图8D)。3．2．3移植物免疫荧光染色在含有生精小管样结构的移植物中，可见多个MVW的细胞，排列相对整齐， 上海交通大学博士学位论文可观察到MV一／GFP+细胞(图9A、B、C)。舞譬豢嚣燃蓉””麓鬻嚣戮“”““”“2¨∞^∞，黼In∞，{s2∞．OOi№t，陬27，2。10嚣嚣稿tⅫ一}蛾*Ⅻ，￡t一峨≈m“，㈨#；‰K～、珏≈‘k“二H{鬻譬喾嚣誉蕊雾。脚鬃絮j嚣‘器；“”⋯B图7新生小鼠睾丸细胞与iPS细胞共移植后移植物的生长情况Figure7TissuegeneratedbytransplantatingiPScellswithtesticularcells(confirmedbyGFPfluorescenceinthetissue)A．移植后4w；B．移植后6w；C．移植后8W。36 上海交通大学博士学位论文图8睾丸细胞与iPS细胞共移植的移植物HE染色(标尺：20岬)Figure8Histologicalappearanceoftissueformedafterco-transplantationofisolatedtesticularcellsandiPScellstohostmice(HEstained)(Scalebars=20Ⅲn)A．C：畸胎瘤(A．外胚层，☆示神经上皮；B冲胚层，☆示肌组织；c．内胚层，☆示呼吸道上皮)。D：移植物中的生精小管样结构(箭头所示)37 上海交通大学博士学位论文38 上海交通大学博士学位论文图9睾丸细胞与iPS细胞共移植后第6W移植物MVH免疫荧光染色(标尺：50lxm)Figure9ImmunofluorescencestainingofgermcellsgeneratedbytransplantatingiPScellswithneonataltesticularcells，antibodyusedWaSagainstMVH(Scalebars=50rma)(红色荧光：阳性信号；绿色荧光：GFP；蓝色荧光：DAPI)A．箭头示MⅥ{+的生殖细胞；B．箭头示MVH+／GFY细胞；C．对照3．3讨论干细胞是一类具有多向分化潜能和自我更新能力的原始细胞【94】，其命运在很大程度上受周围环境特别是干细胞niche的影响【95，96]。干细胞niche即干细胞“壁龛”、“小生境”，是干细胞居留的微环境，包括壁龛细胞、细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)和来源于壁龛细胞的可溶性因子[97】，影响着干细胞的增殖和分化，通过与干细胞之间的直接和／或间接作用而影响干细胞的命运。1978年，干细胞niche这一假说是在研究造血干细胞的特殊微环境时提出的【98]，随后在性腺、消化道、皮肤等处也发现类似的niche结构【99】。将iPS细胞与新生小鼠睾丸细胞及睾丸提取液混合移植至裸鼠皮下，由于iPS细胞带有EGFP标记，观测方法简易便捷，利用小动物活体可见光成像系统可以追踪到这些细胞的生长和定植情况。与新生小鼠睾丸细胞移植相似，注射细胞悬液后即可在裸鼠背部观察到半球状隆起，此隆起很快消失，于移植后第2w重新出现，移植后第4～10w时移植物生长迅速。因为iPS细胞是一种多能干细胞，具有分化的多能性，移植物形成了畸胎瘤，但个别包块的生长速度较其它包块慢，在这些包块中观察到了生精小管样结构。免疫荧光结果显示，移植物中的类生精小管的管腔内，部分细胞表达生殖细胞特异性标志物MVH，是生殖细胞；同时观察到少数细胞同时表达GFP和MVH，表明这些细胞是由EGFP+的iPS细胞分化而来的生殖细胞。研究者在研究另一种多能干细胞——ES细胞时发现，将ES细胞种植到免疫缺陷小鼠的脾脏【100]，发现产生的畸胎瘤中有肝细胞所形成的窦状结构。RT-PCR和免疫组织化学显示，这些区域的细胞表达肝细胞特异性标志，首次证明了可在体内将ES细胞诱导成肝细胞，我们的实验同样是将未分化的多能干细胞进行移植，与这一研究思路相似。Yamamoto等【1011将带有标志基因(ALB启动子控制的EGFP)的小鼠ES细胞注射到肝损伤模型的同系小鼠体内，也在肝区形成的畸胎瘤中检测到带有EGFP的肝细胞样的细胞，这些细胞表达肝细胞特异的39 上海交通大学博士学位论文标志物，且为有功能的肝细胞，证明ES细胞能够在体内环境的诱导下向肝细胞分化。不仅如此，这些肝细胞在体外肝细胞培养液等的作用下始终保持着典型的肝细胞形态，经诱导后移植回小鼠体内，未观察到畸胎瘤或肝脏肿瘤，说明体内、体外诱导相结合能够更好地使ES细胞分化为肝细胞。这一结果提示我们，实验中获得的Mv】nGFP+的生殖细胞可能具有正常功能。Kita等[25]将带有GFP标记的生殖干细胞与消化的睾丸细胞一起注射到裸鼠皮下，GFP+的生殖干细胞在重构的生精小管内发育成圆形精子，经体外受精产生了子代。另有报道，将诱导分化的ES细胞与新生小鼠的卵巢细胞共移植至。肾被膜下，ES细胞来源的卵母细胞能够整合入卵巢的niche，并可以募集颗粒细胞，发育至原始卵泡阶段[102]。由上述成功的例子推断，如果将iPS在体外诱导至的生殖细胞前体再移植至体内，iPS细胞分化为生殖细胞的效率可能更高，也许能避免移植过程中成瘤的可能，效果会更好。之前，我们发现Sertoli细胞可以识别位于管腔位置的精原(干)细胞，使其迁移至生精小管的基膜，促使其增殖、分化。本实验中，我们在移植物中检测到了iPS细胞来源的生殖细胞，说明Sertoli细胞提供的微环境及Sertoli细胞与外源细胞之间的识别对iPS细胞的分化起到了关键作用。细胞分化是发育生物学的核心问题之一，睾丸组织中的niche是由Sertoli细胞形成的微环境，上述实验结果说明裸鼠皮下组织能较好地模拟睾丸内的微环境，支持iPS细胞向生殖细胞分化，然而iPS细胞如何在这一特定的微环境中启动向生殖细胞的分化，怎样确定分化方向尚不明确，与此相关的干细胞niche还需要进一步研究，在提高iPS细胞在体内的定向分化效率的同时，避免iPS细胞移植的成瘤问题等值得进一步探讨。相信这一研究对于探讨睾丸内微环境与干细胞之间的相互调控作用，认识精子发生的机制具有一定的价值。小结实验中，我们以免疫缺陷小鼠作为受体，将新生小鼠的睾丸组织、新生小鼠睾丸细胞移植至受体的皮下组织，并在此基础上，联合新生小鼠睾丸细胞和iPS细胞共同移植，观察移植物在异位的生长、发育情况。结果显示：①1~2d龄小鼠的睾丸组织可以在裸鼠皮下组织进一步生长发育，完成精子发生过程，形成精子。②新生小鼠睾丸细胞移植入受体的皮下组织后，供体细胞可以自成组织，重构形成生精小管样结构，所移植的精原(干)细胞和Sertoli细胞可在异位进一步发育，裸鼠皮下组织可以提供精子发生的微环境。⑧在上述微环境 上海交通大学博士学位论文中，iPS细胞可以向生殖细胞分化，但效率低，且易形成畸胎瘤。10．11．12．13．14．参考文献Bhasin，S．，eta1．，Thegeneticbasisofmaleinfertility．EndocrinolMetabClinNorthAm，1998．27(4)：p．783-805，viii．Ogawa，T．，Spermatogonialtransplantation：theprincipleandpossibleapplications．JMolMed(Berl)，2001．79(7)：P．368-74．deKretser，D．M．，eta1．，Spermatogenesis．HumReprod，1998．13Suppl1：P．1．8．Ogawa,T．，eta1．，Xenogeneicspermatogenesisfollowingtransplantationofhamstergermcellstomousetestes．BiolReprod，1999．60(2)：P．515·21．DeRooij，D．G．，F．M．VanDissel-Emiliani，andA．M．VanPelt，Regulationofspermatogonialproliferation．AnnNYAcadSci，1989．564：P．140-53．deRooij，D．G．andL．D．Russell，AHyouwantedtoknowaboutspermatogoniabutwereafraidtoask．JAndrol，2000．21(6)：P．776—98．deRooij，D．G．，Proliferationanddifferentiationofspermatogonialstemcells．Reproduction,2001．121(3)：P．347-54．Ewing，L．L．，J．C．Davis，andB．R．Zirkin，Regulationoftesticularfunction：aspatialandtemporalview．IntRevPhysiol，1980．22：P．41—115．Sofildfis，N．，eta1．，Influenceofthemalereproductivetractonthereproductivepotentialofroundspermatidsabnormallyreleasedyontheseminiferousepithe矗um．HumReprod，1999．14(8)：P．1998—2006．Huleihel，M．andE．Lunenfeld，Regulationofspermatogenesisbyparacrine／autocrinetesticularfactors．AsianJAndrol，2004．6(3)：P．259-68．Gnessi，L．，A．Fabbri，andG．Spera，Gonadalpeptidesasmediatorsofdevelopmentandfunctionalcontrolofthetestis：anintegratedsystemwithhormonesandlocalenvironment．EndocrRev，1997．18(4)：P．541—609．Saunders，P．T．，Germcell-somaticcellinteractionsduringspermatogenesis．ReprodSuppl，2003．61：P．91-101．DeGendt，K．，eta1．，ASertolicell-selectiveknockoutoftheandrogenreceptorcausesspermatogenicarrestinmeiosis．ProcNatlAcadSciUSA，2004．101(5)：P．1327-32．Hill，C．M．，eta1．，Intratesticularandrogenlevels,androgenreceptor41 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上海交通大学博士学位论文95．Spradling，A．，D．Drummond-Barbosa，andT．Kai，Stemcellsfindtheirniche．Nature，2001．414(6859)：P．98-104．96．Watt，F．M．andB．L．Hogan，OutofEden：stemcellsandtheirniches．Science，2000．287(5457)：P．1427·30．97．Lin，H．，Thestem—cellnichetheory：lessonsfromflies．NatRevGenet，2002．3(12)：P．931-40．98．Schofield，R．，Therelationshipbetweenthespleencolony@rmingcellandthehaemopoieticstemcell．BloodCells，1978．4(1-2)：P．7-25．99．Fuchs，E．，T．Tumbar，andG．Guasch，Socializingwiththeneighbors：stemcellsandtheirniche．Cell，2004．116(6)：P．769-78．100．Choi，D．，eta1．，Invivodifferentiationofmouseembryonicstemcellsintohepatocytes．CellTransplant，2002．11(4)：P．359·68．101．Yamamoto，H．，eta1．，Differentiationofembryonicstemcellsintohepatocytes：biologicalfuncaonsandtherapeuticapplication．Hepatology，2003．37(5)：P．983．93．102．Nicholas，C．R．，eta1．，Transplantationdirectsoocytematurationfromembryonicstemcellsandprovidesatherapeuticstrategyfo，．femaleinfemlity．HumMolGenet，2009．18(22)：P．4376-89．48 上海交通大学博士学位论文第二部分诱导iPS细胞向生殖细胞分化干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。根据干细胞所处的发育阶段，干细胞可分为胚胎干细胞(emb巧omcstemcell，ES细胞)和成体干细胞，后者存在于机体的各种组织器官中，是已经分化组织中的未分化细胞。按其分化潜能的大小，干细胞可分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。近年来，在生物医学研究领域，多能干细胞成为研究胚胎发生、细胞分化以及基因调控等的理想模型，也是细胞治疗、再生医学和药物筛选等的重要研究工具。ES细胞是从囊胚的内细胞群分离出的多能性干细胞，可在体内分化为包括生殖细胞在内的几乎所有类型的细胞。将ES细胞导入植入前的胚胎，前者可整合其中并参与正常的胚胎发育，形成机体中包括生殖细胞在内的所有细胞，而不产生肿瘤。基于这一点，ES细胞为个体发育、细胞分化的研究提供了独特的研究视角。近年来，受环境、社会、精神心理等因素的影响，男性精子的数量和质量呈下降的趋势，男性不育症的发病率逐年上升，其中约50％是由于精子生成异常或功能缺陷所导致[1】，因此探讨生殖细胞的发育、分化及其分子机制至关重要。辅助生殖技术的发展为不少不育症患者带来了后代，但由染色体数量和结构异常或基因突变所致的遗传性不育(如少精症、无精症等)却难以治疗，由于这些患者不能产生生殖细胞或功能正常的精子，无法通过辅助生殖技术获得治疗[2】。哺乳动物的精子起源于原始生殖细胞(primordialgermcells，PGCs)。研究发现，ES细胞可在体外诱导分化为PGCs[3．14]，后者能进一步分化为精子细胞，并可产生子代[7】，这些研究成果不仅为生殖细胞的发生及其调控机制的研究提供了一个重要的体外模型，而且为不孕不育症的治疗开辟了崭新的思路。但如果将人ES细胞诱导分化成雄性配子，用于疾病的治疗，需要获得个体自身来源的ES细胞，这必然涉及到卵子赠送、胚胎销毁等伦理问题。因此，从干细胞角度探索精子的发生必须寻找其他来源的干细胞，这种干细胞最好来源于患者自身的组织，具有多能性且容易获得。2006年，诱导多能干细胞(reducedpluripotemstemcells，iPS细胞)的建系成功，解决了干细胞的来源问题。iPS细胞从成体细胞经外源性特定因子诱导而来，取材痛苦小，材料充足，而且避免了使用ES细胞的免疫排斥和伦理学问题，受到研究者的青睐，成为干细胞领域的又一研究热点。49 上海交通大学博士学位论文已经证明，iPS细胞在形态学、增殖特性、干细胞标志物的表达、表观遗传学修饰等许多方面具有与ES细胞一致的特性[15]。2009年，研究者通过四倍体补偿技术ZiPS细胞获得了子代，证明iPS细胞具有与ES相似的全能性[16，17]，从而说明完全通过体外操作可以得到与ES细胞具有同样分化能力的细胞，大大拓展了iPS细胞的应用前景。2007年以来，iPS细胞的研究取得了很大进展。研究者用iPS细胞成功治疗了小鼠的镰状红细胞贫血症和小鼠血友病【18，19]，并将人iPS细胞成功诱导成多巴胺神经元[201、能分泌胰岛素的胰岛样细胞【21】以及肝细胞等[22】。不仅如此，研究者还将患者的体细胞重编程获得了特异的iPS细胞，拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离，使之成为研究疾病发生机理及细胞替代性治疗的重要工具。目前，iPS细胞向生殖细胞诱导分化的研究较少【23-27]，如果将其引入生精障碍的研究，将患者的体细胞诱导重编程为iPS细胞进行培养；再通过基因工程，修复iPS细胞中的基因缺陷；然后再将iPS细胞经体外诱导分化后、或直接移植回患者体内，发挥治疗作用，使疾病和患者特异的基因治疗、药物设计成为可能。理论上可以解决干细胞材料稀缺和免疫排斥问题，可以进行各器官的、无限次的治疗。因此，iPS细胞有望成为研究生殖细胞发育和不育症发病机理及治疗的有效手段，并成为雄(男)性生殖细胞的新来源。本实验以iPS细胞为研究对象，探讨其在体外向生殖细胞分化的潜能，为建立iPS细胞体外诱导培养体系提供实验依据。4．1材料与方法4．1．1实验动物孕13．5天的ICR小鼠，由中国科学院实验动物中心提供。4．1．2实验材料EGFP．miPS4．1(iPS4．1：C57来源，40，XY)，mES(ES：C57来源，40，XY)，由上海交通大学健康科学研究所金颖研究员馈赠。主要器械：眼科直剪4把、眼科直镊4把、解剖镊2把、200目尼龙滤膜等，以上物品均经高压灭菌消毒处理。15n、50IIll塑料离心管(Coming公司)，细胞培养皿、细胞培养板(Coming公司)等。4．1．3主要试剂50 上海交通大学博士学位论文DMEM(高糖)DPBS胎牛血清(fetalbovingserum，FBS)青／链霉素溶液HycloneUSAHycloneUSAHycloneUSAHycloneUSA(penicillin／Streptomycinsolution，P／S)0．05％Trypsin-EDTAGibcoUSA0．25％Trypsin—EDTAGibcoUSAL-谷氨酰胺(L·glutamin)GibcoUSA非必需氨基酸GibcoUSAp．巯基乙醇GibcoUSA白血病抑制因子(1eukemiainhibitoryfactor，LIF)ChemiconUSAI型DNA酶(DnaseI)AppliChemGermany丝裂霉素CSigmaUSA明胶SigmaUSADMSOAmrescoUSA维甲酸SigmaUSAⅣ型胶原酶InvitrogenUSA透明质酸酶SigmaUSA干细胞因子(stemcellfactor，SCF)InvitrogenUSA碱性成纤维细胞生长因子InvitrogenUSA(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)TritonX-100SigmaUSA牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)SigmaUSATrizolInvitrogenUSADEPCSigmaUSA阶段特异性胚胎抗原l(s切ge．Specificemb巧。11icantigenl，ssEA．1)AbcamusAintegrin-93AbeamUSAOct4AbeamUSAC．kitAbeamUS：AMVHAbeamIJSA5l 上海交通大学博士学位论文SCP3AbcamUSABCIP／NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒碧云天ChinaRT-PCRKitTaKaRaJapanTris、冰醋酸、氯仿、异丙醇、无水乙醇等一般化学试剂购自上海试剂一厂。4．1．4主要溶液MEF培养液：FBS10％P／S0．5％DMEM(高糖)MEF冻存液：DMEM(高糖)70％FBS20％DMSO10％iPS／ES细胞培养液：FBS15％非必需氨基酸1％L．谷氨酰胺1％D．巯基乙醇0．2％LIF100U／mlP／S1％DMEM(高糖)iPS／ES细胞冻存液：FBS90％DMSO10％类胚体(embryoidboay，EB)培养液：FBS15％非必需氨基酸1％52 上海交通大学博士学位论文L．谷氨酰胺1％p-巯基乙醇0．2％P／S1％DMEM(高糖)EB消化液：Ⅳ型胶原酶透明质酸酶PBS2mg／ml4mg／ml定容生殖细胞(germcell，GC)培养液：bFGF15ng／mlSCF30ng／rra全反式维甲酸(retinoicacid，RA)(在使用前加入)2ktMiPS／ES培养液定容50×TAE缓冲液(500“)：Tris242g冰醋酸57．1ml0．5MEDTA(pH8．0)100ml10％SDS1m1ddH20定容1．2％琼脂糖凝胶：琼脂糖1．2g50×TAE缓冲液2“ddH20加至100ml微波炉加热至琼脂糖溶解，待冷却至65。C时，加入GoldView，混匀。丝裂霉素C储存液：2mg丝裂霉素C，DPBS定容至2ml，4。C保存。0．1％明胶溶液：称取明胶0．1g，ddH20定容至100ml，4。C保存。53 上海交通大学博士学位论文0．3％TritonX-100：0．3mlTritonX．100溶于99．7ml的PBS中，混匀，4℃保存。封闭液(5％BSA)：BSA59，PBS定容至100ml，4"C保存。4．1．5主要仪器C02培养箱ThermoUSA超净工作台ESCOUSA荧光倒置相差显微镜NikonJapan低速离心机(Centrifuge5415R)EppendorfGermany台式高速离心机(Centrifuge5810R)EppendorfGermany超低温冰箱ThermoUSA超纯水仪MilliporeGermany紫外／可见分光光度计NanoDropUSA电泳仪BIO．RADUSA凝胶图像分析系统BIO．RADUSA激光共聚焦显微镜(LSM-510)CarlZeissGermanyFACSCalibur流式细胞仪BectonDickinsonUSA4．1．6实验方法4．1．6．1小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblasts，MEF)的培养1)MEF的制备①用颈椎脱臼法处死孕鼠，将其置于75％乙醇中浸泡5mill；②在超净台中剪开孕鼠皮肤、腹部肌层，暴露子宫，用眼科镊提起近子宫颈端，分离子宫系膜，剪断子宫角，将子宫小心取出，置于盛有DPBS的培养皿中，DPBS冲洗以去除血液。③剪开子宫，将羊膜与胎盘分离，把包裹着羊膜的胚胎移入另一盛有DPBS的培养皿中，冲洗。④去除羊膜，暴露胚胎，DPBS冲洗三次。⑤用解剖镊小心夹掉胚胎的头、尾及四肢，去除内脏(肝脏、肠管等)，将余下的胚胎组织转移到盛有DPBS的新的培养皿中，冲洗3次。⑥将所得胚胎组织收集至1．5mlEP管中，静置至组织沉入管底，尽量吸去DPBS，用眼科剪将胚胎组织剪成1n皿3以下的碎片，加入预热的0．05％Trypsin-EDTA(每只孕鼠5“)和DnaseI(每只孕鼠5¨1)，消化约10min，期间不停用加样器吹打， 上海交通大学博士学位论文帮助消化。用两倍体积的MEF培养液中止消化。⑦收集得到含有组织碎片的液体，用200目滤膜过滤，滤液离心(1500rpm、15rain)，弃上清，加入新鲜培养液，得到细胞悬液，铺皿。⑧置于37"C、5％C02饱和湿度培养箱中培养。⑨第2d换液，MEF接近汇合时，即可进行传代培养。2)MEF的传代、冻存与复苏①MEF的传代当培养皿中的细胞达到80％～90％汇合时，可进行传代。弃去培养液，用DPBS液洗涤1次，吸狰DPBS液，加入预热的0．05％Trypsin-EDTA，消化约2-3min，至细胞从皿底脱落下来，加入两倍于消化液体积的培养液中止酶的作用，吸出细胞悬液，将其转至新皿中，补足培养液，完成传代。②MEF的冻存细胞消化(方法同传代)后计数，将细胞悬液收集到离心管内，以1000rpm离心5min，弃上清，按适当比例加入MEF冻存液，反复吹打、混匀，以每管1～1．5lIll加入细胞冻存管，细胞冻存管转入冻存盒并置于．70"C冰箱过夜，次日转入液氮中进行长期冻存。③MEF的复苏从液氮中取出冻存细胞，37℃快速复温至融化，将细胞悬液吸至离心管，加入预热的MEF培养液，1000rpm离。L,5min，弃上清，加入培养液重悬细胞，铺皿，于37。C、5％C02饱和湿度培养箱中培养。3)饲养层细胞的制备选第3～5代的MEF，用丝裂霉素C法进行处理，制备饲养层细胞。培养皿预处理：0．1％明胶处理至少1h。待细胞生长至90％以上融合时，弃除旧的培养液，加入含丝裂霉素C(终浓度为10pg／mL)的MEF培养液继续培养2-3h。之后，弃去含丝裂霉素C的培养液，DPBS液洗5遍，用于接种iPS／ES细胞或以一定密度冻存备用。4．1．6．2iPS／ES细胞的培养1)iPS／ES细胞的复苏从液氮中取flSiPS细胞(第30-50代)、ES细胞(第30-50代)，37"C快速复温至融化，立即加入等体积的iPS细胞培养液，1000rpm，离心5rain。弃上清，用iPS／ES 上海交通大学博士学位论文培养液重悬细胞，接种至预先铺有饲养层的培养皿中，继续培养。一般每天换液，在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况。2)iPS／ES细胞的传代一般2~4d传代一次。弃除旧培养液，DPBS液洗一遍，加入0．25％Trypsin_EDTA，iPS／ES细胞连同MEF消化成单细胞，用iPS／ES细胞培养液终止消化，视细胞密度以1：3～1：5传至新的经丝裂霉素C处理过的MEF上，补足培养液，继续培养。3)iPS／ES细胞的冻存细胞消化的步骤同传代，用iPS／ES细胞培养液终止消化，将细胞悬液收集到离心管内，以1000rpm离心5min，弃上清，按适当比例加入iPS／ES冻存液，吹打、混匀，以每管1“的量加入细胞冻存管，细胞冻存管转入冻存盒并置于．70"C冰箱过夜，次日转入液氮中进行长期冻存。4．1．6．3EB的制备：iPS／ES细胞常规消化成单细胞，EB培养液重悬，将细胞悬液转入铺有明胶的培养皿中30～60min，去除MEF。细胞计数，以1～1．5×105／ml的浓度进行悬滴。以20叫滴，使每滴悬液均匀的滴至平皿的上盖内表面，上盖迅速扣至事先加入少量PBS的下盖上，放于细胞培养箱中培养。24~48h后，在每一个悬滴液体可用肉眼看到一个白色颗粒状物体，即为EB。3d后，将类胚体由皿盖转入细菌培养皿中培养。与不同时间点收集EB，用于后续实验。4．1．6．4反转录聚合酶链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT．PCR)1)RNA抽提①8W龄雄性ICR小鼠：麻醉后处死，取一小块睾丸组织，迅速置于液氮中冷冻。将睾丸组织放入200℃烘烤4h处理过的匀浆器中，加入1mlTrizol，冰上匀浆至无明显组织块，室温孵育匀浆后的混合物5min。iPS／ES细胞：iPS／ES细胞常规消化，细胞悬液移至铺有明胶的皿中，静置30--45min以去除MEF，悬液以800rpm离心5min，弃去液体，DPBS重悬，800rpm离心5min，弃去DPBS，加入1mlTrizol，冻于-80℃保存。EB：收集不同时间点的EB，液体以800rpm离心5min，弃去液体，DPBS重悬，800rpm离心5min，弃去DPBS，加入1mlTrizol，冻于．80"C保存。 上海交通大学博士学位论文②4。C，12，000rpm离心10min，转移上清至新的无RNA酶污染的1．5“EP管中。按200叫1mlTrizol的比例加入氯仿，颠倒混匀离心管30s，室温静置5min。③4。C，12，000rpm离心15min，小心转移上层水相至另一无RNA酶污染的1．5IIllEP管中。加入与水相等体积的异丙醇(约0．5ml／1mlTriz01)，轻摇混匀，室温孵育10rain。④4。C，12，000rpm离心10min，可见管底白色RNA沉淀；弃上清。⑤加入用RNaseFree水配制的75％乙醇1ml，振荡重悬。⑥4。C，12，000rpm离心10min，弃上清。⑦95％7,醇1“再洗一次。4。C，12，000rpm离心10min，小心尽量弃尽上清。⑧倒置EP管于灭菌滤纸上，室温空气干燥RNA沉淀5。10rain，至沉淀变白，根据产量用10—50山RNaseFree水溶解RNA。必要时用移液器轻轻吹打以溶解沉淀。⑨紫外分光光度计测量所提取的RNA的纯度与浓度，1．2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。⑩冰上分装，．80℃保存。2)引物设计表1RT-PCR引物序列和反应条件Table1PrimersusedinRT-PCRanalysis引物名称引物序列(5'-3’)引物大小退火温度(F：forward，正向；R：reverse，反向)(℃)F：1、ACACAGCCACCTGGGACTACAcrosin343bp56R：GGAGACGCCGAGCAAAAGACF：CCAACTGGGACGACATGGAGActin294bp56R：TGGCGTGAGGGAGAGCATAGF：TTGGCAAAGAAGACAGCGACGCc．Kit369bp57R：CTTTAGCCACATGGAGTTCACGGF：ATGGCTCAGTAAAAGAAGTGAAGATAADazl176bp54R：AGTACATAAATTTTGTTTCCTGATTGCF：CGT—汀CAAGCTGGCCCTCAAGHlt385bp56R：ACTTCCTCCCTGCTGCCTTCOct4F：CACCTGGCTTCAGACTTCGC309bp56 上海交通大学博士学位论文R：GGAGGTTCCCTCTGAGTTGCF：CAGAAGCATCAGGCCCGTTC蝴437bp56R：TGCCGGTGGTGCATCATGTCF：AGAAGACTCCAGCCCACCACPiwil2359bp56R：AGGCACTGGGAGGTTTGTCCF：ATGCAGAAGGCGGAGGAGACPrm2289bp56R：TGGCAGGTGGCTTTGCTCAGF：CTGGGAAGCCACCTTTGGTTGScp3372bp56R：GTTCCCACTGCTGCAACACATTCF：CCTGCGTGTTCCACAAGTGTCStra8335bp56R：GAAGGATGCTTTGAGCTTCAGC3)PCR反应①逆转录反应：OligodTPrimerdNTPMixtureTotalRNARNasefreedH20②PCR仪上变性、退火：65℃5minI冰上急冷③反转录反应液的配制：上述变性、退火后反应液5xPrimeScript⑧BufferRNaseInhibitorPfimeScfipt⑩RtaseRNaseFreedH20Total④PCR仪上反应：42℃45minl1¨l1rtl1pgupto10“l10山4斗l0．5lxl1“14．5“120“l58 上海交通大学博士学位论文95℃5min⑤PCR反应体系：TaKaRaExTaqHSO．25“l10×ExTaqBuffer(M92+Plus)5“ldNTPMixture(各2．5mM)4plForwardPrimer(20laM)0．5山ReversePrimer(20laM)0．5斗leDNA50ngdn20upto50山⑥PCR反应：94℃，4minl(94。C，30s一55。C，30s一72℃，lmin)X30CyclesI72℃，5min1．2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像处理系统在紫外光下检测上述基因的表达。4．1．6．5流式细胞分析术EB的消化：收集第7d的EB，所得细胞悬液800rpm离心5min，弃去液体，加入DPBS重悬，800rpm离心5min，弃上清，加入预热的EB消化液，消化15-30min。之后，加入0．05％Trypsin-EDTA作用10-30min，至EB消化成单细胞，GC培养液终止消化，800rpm离心5min。消化所得的单细胞，以DPBS重悬，加入荧光标记的SSEA．1(AlexaFluro647，1：50)、integrin,133-PE(1：20)，4。C孵育30min。1000rpm离心5min，弃上清。DPBS洗涤，1000rpm离心5min，弃上清，重悬于200“lPBS中，流式细胞仪检测(阴性对照：不加抗体，细胞重悬于PBS中)。4．1．6．6iPS／ES细胞诱导分化EB消化所得的单细胞，接种至丝裂霉素C处理过的MEF上，加入含有bFGF和SCF的iPS／ES培养液培养，隔日换为GC培养液继续培养。所形成的克隆以挑克隆的形式传代至新的经丝裂霉素C处理过的MEF上。观察、拍照，用于后续实验。59 上海交通大学博士学位论文4．1．6．7碱性磷酸酯酶染色(依试剂盒步骤)①取培养有iPS／ES细胞、诱导分化得到的细胞的小圆玻片，PBS洗5minX3次。②4％多聚甲醛固定15min，PBS洗5minX3次。③按照如下比例依次加入各溶液：BCIP溶液10山、NBT溶液20pl、碱性磷酸酯酶显色缓冲液3“，混匀后配制成BCIP／NBT染色工作液。④去除PBS，加入适量BCIP／NBT染色工作液。⑤室温避光孵育5min。⑥去除BCIP／NBT染色工作液，用ddH20洗涤1～2次，终止显色反应。⑦镜下观察，拍照。4．1．6．8细胞免疫荧光染色①取培养有iPS／ES细胞、诱导分化得到的细胞的小圆玻片，PBS洗5minX3次。②4％多聚甲醛固定15min，PBS洗5minX37X。③滴加0．3％TritonX一100，室温15min，破膜。@PBS洗5minX3次，滴!Jfl5％BSA，室温封闭1h。⑤滴加一抗(兔抗Oct4、C-kit、MVH，1：50)，4。C过夜。@PBS洗5minx3次，滴2HAlexaFluro标记羊抗兔IgG，1：200，37"C孵育1h。@PBS洗5minX3次，DAPI(1：200)染核10min。⑧PBS洗5minx3次。⑨甘油PBS封片，激光共聚焦显微镜观察、拍照。阴性对照：用PBS代替一抗，余步骤相同。4．2实验结果1)iPS／ES细胞的形态iPS细胞呈克隆状生长，克隆多为圆形或纺缍形，细胞表面折光性强，边缘光滑、清晰。细胞体积小、排列紧密、界限不清；胞核大、核质比高，有一个或多个核仁，与ES细胞相似。iPS细胞带有EGFP，在荧光倒置显微镜下克隆呈绿色(图lO)。2)EB形态iPS和ES细胞形成的EB呈球形，悬浮于培养液中。因iPS细胞带有EGFP，所形成的EB在荧光倒置显微镜下为绿色球状(图11)。3)RT．PCR 上海交通大学博士学位论文在所检测的基因中，Oct4为多能性标记基因，C-kit、Dazl、Piwil2、Stra8、MVH、Scp3、Hit、m12、Acrosin均为生殖细胞的标志物。C-kit参与PGCs的迁移、增殖及分化，是精原细胞的标志物。Dazl为生殖细胞特异性标志物，DAZL缺失可导致生殖细胞停滞于减数分裂前期。Piwil2基因在SSCs的自我复制中起重要作用。Stra8是减数分裂前生殖细胞特有的标志物。MVIt为生殖细胞特异性标志物。Scp3是精子发生的必需基因，为生殖细胞减数分裂的高度特异性标志。Hit为精母细胞的标志物。P嗍2在精子形成过程中发挥着重要作用。Acrosin是精子细胞标志物。iPS细胞及其来源的3d／5d／7d．EB表达多能性基因Oct4，减数分裂前基因C-kit、Dazl、Piwil2、Stra8及部分减数分裂后基因如MVIt、Scp3、Hit，不表达_Prm2、Acrosin。ES细胞及其来源的3d／5d／7d-EB：表达多能性基因Oct4，减数分裂前基因C-kit、Dazl、Piwil2、Stra8以及部分减数分裂后基因如M矽H、Scp3、Hit、Acrosin，不表达Prm2。结果显示：iPS细胞与ES细胞在基因表达上具有相似性，二者所形成的EB的基因表达也相似(图12)。4)流式细胞分析术iPS形成的EB(7d)qbSSEA-I+／integrin-[33+细胞的百分比为1．35％。ES细胞形成的EB(7d)中SSEA-I+／integrin-[13+细胞的百分比为2．69％(图13)。5)RA诱导后形成的克隆与ES细胞经诱导后的情形相似，iPS细胞来源的EB经RA诱导后逐渐形成克隆，克隆较松散，边界不清，约5～7天传代一次，可被认为是PGCs样细胞，我们将之命名为生殖干细胞(germstemcell，GSC)(图14)。6)碱性磷酸酶染色未分化的iPS细胞和ES细胞被染为棕黑色，呈阳性。由iPS／ES细胞诱导得到的GSC克隆也被染为棕黑色，呈碱性磷酸酶阳性(图15)。7)细胞免疫荧光染色iPS细胞表达多能性标志蛋Oct4，不表达C．kit、MVH蛋白。ES细胞表达Oct4，不表达C．kit、MVH。iPS细胞来源的GSC：Oct4+、C．kit+、删，与ES细胞来源的GSC一致(图16)。 ——一上海交通大学博士学位论文————————————————————————————————————————————————————一图10EGFP-iPS4．1(iPS细胞)、ES细胞的形态(标尺：20脚)Figure10PhasecontrastandfluorescenceimagesofEGFP．iPS4．1(iPS)cellsandEScellsculturedintheundifferentiatedstate(Scalebars=20¨m)A1、A2：iPS细胞；B：ES细胞图11EB的形态(标尺：20啪)Figure1PhasecontrastandfluorescenceimagesofEBsderivedfromiPScellsandEScells(Scalebars=20“m)A1、A2：iPS细胞形成的EB；B：ES细胞形成的EB．62 上海交通大学博士学位论文A4．0et4S罐3H礁A硪8Scp3H魏A翻图12RT-PCR检测多能性标记物和生殖细胞标记物Figure12Reversetranscription--polymerasechainreactionfortheidentificationofOct4andgermcellmarkersA：iPS细胞及其EB；B：ES细胞及其EB．睾丸(Testis)作为对照．，HP毫卜l簿I睢TEGRINPE洲E椭撇菇a赫耐—奄■——嚣——《嚣峨饕e急‘L9稿2'9—S蠊々0,00Q嘲一毫嘲●精菇铂I埘UL祷00$UR12霉'．35娃蛳搏够嚣晴瑚睁巷．辅63B涮≮◇嚣量铡量燃并G秘H谯0e。90壤§0,00LLlO，嗣键je垤豫{孵铡孽嘲鬈岱曲喇tt钓副持撼拣獭2舶址黼瓣麓蠊79经∞魏～矿。篷≮冬r需lj，心_t毒一_§tj掌心一。氐摹一Uk《I_《址竹傩 上海交通大学博士学位论文图13流式细胞术分选SSEA-l+／integrin-133+Figure13Fluorescence·activatedcellsortingbySSEA·1andintegrin-p3A：iPS细胞形成的EB；B：ES细胞形成的EB．图14RA诱导后形成的GSC克隆(标尺：20岫)Figure14Fluorescence·activatedcellsortingwithSSEA-1andintegrinp3(Scalebars220I．tm)A：iPS细胞来源的GSC；B：ES细胞来源的GSC．箭头示诱导分化后形成的克隆图15碱性磷酸酶染色(标尺：20岬)Figure15Alkalinephosphatasestain(Scalebars--20岬)A：iPS细胞；B：ES细胞；C：iPS细胞来源的GSC；D：ES细胞来源的GSC． 上海交通大学博士学位论文iPScellsEScellsGSCderivedfromiPScellsGSCderivedfromEScellsGFPOct4DAPIMerged65一一当型习一1√一一]◆ 上海交通大学博士学位论文iPScellsEScellsGSCderivedfromiPScellsGSCderivedfromEScellsGFPC—kitDAPIMerged 上海交通大学博士学位论文iPScellsEScellsGSCderivedfromiPScellsGSCderivedfromEScellsGFPMVHDAPIMerged图16细胞免疫荧光染色(iPS细胞、ES细胞诱导前、后)(标尺：20txm)(红色荧光：阳性信号；绿色荧光：GFP；蓝色荧光：DAPI)Figure16ImmunofluorescenceofundifferentiatedcellsandGSCderivedfromiPSandEScells(Scalebars=20pan)A1-A4：Oct4(A1：iPS细胞；A2：ES细胞；A3：iPS细胞来源的GSC；A4：ES细胞来源的GSC)；BI．B4：C．kit∞l：iPS细胞；B2：ES细胞；B3：iPS细胞来源的GSC；B4：ES细胞来源的GSC)；C1．C4：MVH(C1：iPS细胞；C2：ES细胞；C3：iPS细胞来源的GSC；C4：ES细胞来源的osc)．67 上海交通大学博士学位论文4．3讨论2006年日本科学家Yamanaka利用病毒载体将四个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c．myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到了一种多能干细胞一PS细胞。iPS细胞细胞具有分化多能性和自我更新的能力，与ES细胞非常类似。目前已成功获得小鼠和人的不同体细胞来源的iPS细胞，并不断探索提高其重编程效率和安全性的有效方法。研究发现，人iPS细胞可在体外诱导形成生殖细胞[23．25]，甚至可以形成单倍体【25]，小鼠iPS细胞同样可以向生殖细胞分化[26，27]。然而，最近的研究表明，不同iPS细胞株之间存在差异[28]，本实验以小鼠EGFP．iPS4．1细胞为研究对象，在体外对其诱导分化，探讨其发育形成生殖细胞的潜能。实验中，我们以13．5d的胎鼠制备的MEF作为iPS／ES细胞的饲养层，在含有LIF的培养液中培养，iPS可以正常地增殖传代，形态学和碱性磷酸酶染色结果表明，在我们的培养条件下的iPS细胞与ES细胞相似。在体外诱导ES细胞分化，多采用单层细胞贴壁培养和制备EB的方法。为更好地模拟体内的微环境，我们在iPS细胞扩大培养后，去除MEF以及培养液中的维持干细胞未分化状态的LIF[29，30]，以悬浮培养的方式制备了EB。悬浮培养时，干细胞相互聚集，形成球形的EB。EB包含有内、中、外三个胚层，其发育分化过程与正常胚胎的发育惊人的相似[31]，被认为是在体外模拟胚胎发育的理想模型，在此基础上，可以深入地研究多能干细胞向各种不同类型细胞分化、发育的过程，认为可以模拟体内的PGCs发育[32]。为检i贝IJEB形成过程中细胞的分化情况，我们用RT-PCR检测了多能性基因和生殖细胞相关基因的表达情况，其中Oct4为多能性标记基因，C-kit、Dazl、Piwil2、Stra8为减数分裂前标志物，Mvh、Scp3、剧f、胁2、Acrosin等为减数分裂后标志物。结果发现，iPS细胞及其形成的EB均表达多能性基因Oct4、均表达减数分裂前基因C-kit、Dazl、Piwil2、Stra8及部分减数分裂后基因，女IMvh、Scp3、刖f，与ES细胞相比，无明显差别，并与已有的文献报道类似【5，7，27]。然而iPS细胞及其来源的EB不表达．Acrosin，ES细胞及其形成的EB却表J太_Acrosin，对于这一差别，我们认为可能的原因是：与ES细胞不同，iPS细胞来源于体细胞，经历了重编程过程而获得了多能性，有文献报道iPS细胞表观基因组修饰模式与ES细胞存在细微的差异，可能影响特定 上海交通大学博士学位论文基因的表达，且不同的iPS细胞株之间也可能存在不同[28】。由于ES细胞与PGCs有一些共同的标志物，使二者的鉴别遇到一定的困难。实验中需要参考生殖细胞在各发育阶段表达的基因或蛋白，结合细胞的形态、功能对其进行鉴别。阶段特异性胚胎抗原SSEA-I是一种糖蛋白，是ES特异性的表面标记之一，但同时也是PGCs的表面标志物[10，12，33]。为更好地鉴别EB是否向生殖细胞分化，形成了PGCs样细胞，我们又选择了另一个PGCs表面标志物integrin-p3[34]，对EB中的细胞进行分析。结果显示：iPS细胞、ES细胞的EB中均有SSEA-l+／integrin-133+细胞，可以认为所得SSEA—l+／integrin-133+细胞为PGCs样细胞。接下来，我们尝试从EB中建立类似体内PGCs细胞的生殖干细胞(germstemcell，GSC)系。我们将EB消化成单细胞，铺回至MEF上培养。所用的生殖细胞培养液中含有LIF、SCF和bFGF等细胞因子，并含有维甲酸(retinoicacid，RA)。LIF对培养的PGCs的存活和增殖是必需的，已知bFGF、SCF是一种重要的细胞增殖分化调节剂[35】。RA是维生素A的衍生物，具有广泛的生物活性，对胚胎发育、正常细胞和肿瘤细胞的增殖分化发挥重要调节作用。在生殖细胞的发育过程中，迁移后PGCs不论进入有丝分裂还是停滞在减数分裂，均受RA的调节[36．39】。RA在配子早期发生中发挥重要作用，研究发现，10。6M的RA可以促进ES细胞向生殖细胞分化[40．43】。为此，我们在生殖细胞培养液中添加了10币M的RA。结果发现，从培养第2d开始，逐渐有细胞克隆形成。经RA诱导3d，克隆变得较松散，边缘模糊。研究表明，碱性磷酸酶的高表达与未分化的多能干细胞相关。我们用碱性磷酸酶染色进行检测发现，与未分化的iPS和ES细胞一样，诱导所形成的细胞克隆呈碱性磷酸酶阳性，提示具有多能性。细胞免疫荧光结果显示，未分化的iPS细胞和ES细胞表达多能性标志蛋白Oct4，都不表达精原细胞标志物C．kit以及生殖细胞特异性标志蛋白MVH，而由iPS和ES细胞分化而来的GSC细胞表达均表达Oct4、C．kit及生殖细胞特异性标志蛋白MVH，说明细胞向生殖系发生了进一步的分化。在我们的诱导培养条件下，只有GSC的克隆才可以扩增、传代，传代过程中细胞可以保持干细胞性质，但一般可以传至第4代，传代过程中GSC会逐渐停止增殖。其他克隆都不能生长，逐渐凋亡，在传代中渐渐消失。造成这一现象 上海交通大学博士学位论文可能由于iPS细胞的株间差异，细胞的分化潜能及倾向各不相同。也可能是由胚胎发育过程中PGCs的特性所决定的。据文献报道，胚胎期雄性个体的PGCs会发生有丝分裂的停滞和凋亡，在体外建系培养PGCs来源的GSC系时，会观察到类似体内的现象。我们已经在尝试优化诱导、培养条件，将所得的GSC与Sertoli细胞在Transwell培养皿中共培养，期望借助3D培养体系更好地模拟体内生殖细胞发育所需的微环境，提高诱导效率。有报道，将体外ES细胞诱导分化而来生殖细胞移植至小鼠生精小管中，可促进其分化[3]。我们考虑下一步将体外诱导而来的GSC移植至体内，结合前已述及的研究结果，将其与新生小鼠睾丸细胞共同移植至裸鼠皮下组织或移植至小鼠生精小管中，观察GSC的发育情况以及由其得到的生殖细胞的受精能力，为生殖细胞发育的研究做进一步的探讨。小结我们在体外培养体系中诱导EGFP．miPS4．1细胞向生殖细胞分化，并尝试建立GSC细胞系，通过RT-PCR、流式细胞分析术、细胞免疫荧光等方法，初步探讨了其向生殖细胞分化的潜能。目前，我们在体外诱导iPS细胞所得到的GSC表现出逐步减弱的扩增、传代能力，然而，我们的结果显示EGFP．miPS4．1细胞与ES细胞一样，具有向PGCs发育的潜能，从而为小鼠iPS细胞的定向分化及其机制研究提供了实验依据。接下来我们将努力优化GSC的诱导、培养、建系条件。总之，iPS细胞具有与ES细胞相似的特性，且来源于体细胞，容易获得，可以得到患者和疾病特异性的iPS细胞，具有ES细胞所无法比拟的优势，研究价值高，有望成为研究不育症发病机制及细胞替代性治疗的重要工具。1．2．3．4．参考文献Auger，J．，eta1．，Dec厅neinsemenqualityamongfertilemeninParisduringthepast20years．NEnglJMed，1995．332(5)：P．281-5．Larson，K．L．，cta1．，Spermchromatinstructureassayparametersaspredictorsoffailedpregnancyfollowingassistedreproductivetechniques．HumReprod，2000．15(8)：P．1717-22．Toyooka，Y，eta1．，Embryonicstemcellscanfo册germcellsinvitro．ProcNatlAcadSciUSA，2003．100(20)：P．11457-62．Kee，K．，eta1．，Bonemorphogeneticproteinsinducegermcelldifferentiation70 上海交通大学博士学位论文10．11．12．13．14．15．16．17．18．／而mhumanembryonicstemcells．StemCellsDev,2006．15(6)：P．831—7．Wbi，W，eta1．，Primordialgermcellspecificationfromembryonicstemcells．PLoSOne，2008．3(12)：P．e4013．West，ED．，eta1．，KITligandandbonemorphogeneticproteinsignalingenhanceshumanembryonicstemcelltogerm—likecelldifferentiation．HumReprod．25(1)：P．168-78．Nayemia，K．，eta1．，Invitro-differentiatedembryonicstemcellsgiverisetomalegametesthatcangenerateoffspringmice．DevCell，2006．1l(1)：P．125．32．Kerkis，A．，eta1．，Invitrodifferentiationofmalemouseembryonicstemcellsintobothpresumptivespermcellsandoocytes．CloningStemCens，2007．9(4)：P．535-48．Aflatoonian，B．，eta1．，Invitropost-meioticgermcelldevelopmentfromhumanembryonicstemcells．HumReprod，2009．24(12)：P．3150-9．Geijsen，N．，eta1．，Derivationofembryonicgermcellsandmalegametesfromembryonicstemcells．Nature，2004．427(6970)：P．148-54．Lacham-Kaplan，O．，H．Chy,andA．Trounson,Testicularcellconditionedmediumsupportsdifferentiationofembryonicstemcellsintoovarianstructurescontainingoocytes．StemCells，2006．24(2)：P．266—73．Clark，A．T．，eta1．，Spontaneousdifferentiationofgermcellsfromhumanembryonicstemcells觑vitro．HumMolGenet，2004．13(7)：P．727-39．Hubner，K．，cta1．，Derivationofoocytesfrommouseembryonicstemcells．Science，2003．300(5623)：P．1251-6．Novak，I．，eta1．，Mouseembryonicstemcellsfo册follicle—likeovarianstructuresbutdonotprogress砌roughmeiosis．StemCells，2006．24(8)：P．1931-6．Boland，M．J．，eta1．，Adultmicegeneratedfrominducedpluripotentstemcells．Nature，2009．461(7260)：P．91-4．Zhao，X．Y，eta1．，iPScellsproduceviablemicethroughtetraploidcomplementation．Nature，2009．461(7260)：P．86-90．Kang，L．，eta1．，谬scellscansupportfurl-termdevelopmentoftetraploidblastocyst-complementedembryos．CellStemCell，2009．5(2)：P．135-8．Xu，D．，eta1．，PhenotypiccorrectionofmurinehemophiliaAusinganiPScell-basedtherapy．ProcNa廿AcadSciUSA，2009．106(3)：P．808-13．71 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上海交通大学博士学位论文结论1．在移植至裸鼠皮下组织后，新生小鼠睾丸组织可以进一步发育，完成精子发生过程，产生精子。2．在移植至裸鼠皮下组织后，新生小鼠睾丸细胞可重新自组织形成生精小管样结构，并可观察到精子发生的恢复，裸鼠皮下组织可以提供支持精子发生的微环境。3．EGFP—miPS4．1细胞与新生小鼠睾丸细胞共同移植至裸鼠皮下组织后，iPS细胞可以向生殖细胞分化。4．在体外的培养体系中，EGFP．miPS4．1细胞形成的EB在RA等的诱导下，形成碱性磷酸酶阳性、且表达多能性标志蛋Oct4和生殖细胞特异性标志蛋白MVH的克隆，提示这些细胞为生殖干细胞。iPS细胞在体外诱导条件下可以向生殖细胞分化。74 上海交通大学博士学位论文综述幼≮Ⅺ：ES、iPS细胞向生殖细胞分化的研究进展多能干细胞是具有潜在应用价值的种子细胞，在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的几乎所有类型的细胞[1】。近年来，随着胚胎干细胞(embryonicstemcells，EScells)、诱导多能性干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPScells)的建系成功，对其分化的研究取得了很大的进展。越来越多的研究显示，二者均可在一定条件下，经体外诱导，分化成为生殖细胞，从而为了解生殖细胞的发育及其机制开辟了新途径，也为人类不孕不育症的研究和治疗提供了新思路。本文就ES、iPS细胞向生殖细胞分化的研究进展作一综述。一、生殖细胞的发育与调节生殖细胞是一个特殊的细胞群体，因其具有将基因组的信息传给子代的功能，从而在动物的生命周期中扮演着举足轻重的角色[2，3]。生殖细胞包括胚胎发育时期的原始生殖细胞(primordialgermcells，PGCs)、生殖母细胞等，成体睾丸内的各级生精细胞、卵巢内的卵母细胞以及最终分化形成的配子(精子和卵子)等多种细胞。1．生殖细胞的发育1．1小鼠生殖细胞的发育生殖细胞的生长周期中有三个重要事件，即生殖细胞的①特化、募集；②迁移、增殖；③定植以及出生前、后性别特异性的发育。PGCs是生殖谱系的祖细胞，在小鼠的胚胎发育过程中，PGCs最初位于靠近卵黄囊的胚外区域，之后迁移至中肠内胚层的上皮，接着由肠上皮进入背系膜，最终定植于生殖嵴[4】，这一过程称为生殖细胞的形成。对于小鼠胚胎，完成这一过程需要7天时间，即从5．5dpc(dayspostcoitum，交配后天数)，上胚层发生第一个生殖细胞谱系的诱导事件开始，至12．5ape，PGCs分化为生殖母细胞时为止【5】。研究发现，小鼠PGCs于7．5dpc时在尿囊的基部特化[6，7]，也有报道认为PGCs来自于近胚外外胚层一个集落[8】。原肠开始形成前不久，外胚层的区域性特化开始，只有靠近外胚层的细胞(直接面对胚外外胚层的那些细胞)才获得向生殖谱系分化的能力[9]。8．5dpc时PGCs开始迁移，跨过后肠和背系膜，10．5dpcN达生殖嵴【10．12】，此时，被称为生殖母细胞[6】，这一过程受严密的分子机制调控[7，13．16]。PGCs75 上海交通大学博士学位论文在迁移的过程中不断增殖，并一直延续到定植于生殖嵴后的2．3天，13．5dpc时生殖母细胞的数目可达25000个左右[17】，此时，已能从形态上区分卵巢和睾丸[8，18，19】。在早期发育阶段，小鼠的雄性、雌性生殖细胞在组成、增殖和迁移方面是完全相同的【2】。12．5dpc，PGCs结束在生殖嵴的定居并根据胚胎的性别开始进行分化[18，20，21]，雄。]生PGCs发生性别决定的时间比雌性PGCs早[221。因此，PGCs是成年卵巢中卵原细胞或是成年睾丸中精原细胞的前体细胞，也是一种胚胎性于细胞。之后，雌性的生殖母细胞经有丝分裂形成卵原细胞，并先后进入第一次减数分裂，形成卵母细胞；而雄性的生殖母细胞则逐渐停滞在Go／G1期，成为前精原细胞，出生后恢复增殖，发育为精原干细胞(spermatogonialstemcell，ssc)[23．26]。有趣的是，如果将雌性PGCs移植到12．5dpc的雄性性腺中，则雌性PGCs停滞于有丝分裂，分化为前精原细胞；反之，将12．5dpc之前的雄性PGCs移植到雌性的性腺或肾上腺、。肾被膜下等其他部位，则雄性PGCs进入减数分裂[27】。性成熟后，排卵前，卵母细胞的减数分裂被激活，但很快又停滞在第二次减数分裂中期，如卵母细胞遇到精子并受精，第二次减数分裂被激活并完成【23，281。对于雄性，青春期后SSC开始分化，启动精子发生，经历精原细胞的有丝分裂增殖、精母细胞的减数分裂、精子细胞的变形，最后形成精子【29]。1．2人生殖细胞的发育哺乳动物生殖细胞发育的研究因其早期事件发生在植入后的子宫内而变得十分困难，这一点在对于人类的研究中更为突出。目前，对于人PGCs的发育仍知之甚少。人PGCs可在胚胎第22天时尿囊的内胚层及间质中检测到。与小鼠PGCs不同的是，人PGCs可根据所表达的标志物的不同分为许多亚群[30，31]，但其特化途径和时间尚未明了。人胚第4周时PGCs开始迁移，并在大约第6周时到达生殖嵴[32】，第7周时，睾丸、卵巢开始分化。在人的胚胎发育过程中，PGCs在进入生殖嵴后形成卵原细胞或前精原细胞，并保持高度增殖[33，341。卵原细胞及前精原细胞的有丝分裂增殖可维持3．4周。约第11～12周时，卵原细胞进入减数分裂(卵母细胞I)，而前精原细胞在胚胎发育的第18--20周时停滞在有丝分裂。PGCs在迁移过程中迅速增殖，每个卵巢在胚胎发育的第16～20周时最多可拥有3×106个卵原细胞[35】。人的卵子发生在这一阶段的特点是生殖细胞发育不同步，至胎儿出生后3个月，处于减数分裂不同时期的卵原细胞和初级卵母细胞仍共同76 上海交通大学博士学位论文存在【33]。1．3生殖细胞的表观遗传修饰生殖细胞在发育过程中不断改变位置的同时，也在进行表观遗传学修饰，越来越多的研究显示，表观遗传修饰是生殖细胞特化过程中的重要组成部分[36．38】。PGCs至U达生殖嵴后，擦除来自双亲的基因印记，主要表现为DNA去甲基化、组蛋白修饰及替换等【36．61]。之后，在生殖细胞的发育过程中，亲本等位基因在精子发生过程中的减数分裂之前出现新的甲基化，而卵子的甲基化则发生在减数分裂之后[39，45，5l，52，56，62-71]。精子与卵子结合后，受精卵进行广泛的表观遗传重编程，重新编程的表观基因组具有发育全能性，为胚胎发育和分化发出正确指令，从而建立性别特异性的印记模式。父本的基因组快速去甲基化，而母本基因组则在第一次卵裂时出现缓慢的去甲基化，使精、卵基因组呈较低的甲基化状态[64，65]。之后，在囊胚植入阶段，新的甲基化模式建立，从而形成一个个体所特有的模式[45，64】。然而介导表观遗传重编程的机制尚不明确。1．4生殖细胞发育的调节已发现，干细胞生长因子(stemcellfactor，SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastfactor，bFGF)、骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticproteins，B脚s)[72．81]以及其他多种转录因子、生长因子和基因参与维持PGCs和生殖母细胞的发育[5，82】。PGCs主要受胚外细胞分泌的外源性因子的诱导，特别是BMP4的作用[83．86】。BMPs包括近半数的TGF．13超家族的成员，骨形态发生蛋白4(BⅧ4)[72]、骨形态发生蛋白8b(BMPSb)、由胚外外胚层细胞产生的Smad信号通路的组成部分以及内胚层来源的骨形态发生蛋白2(BMP2)[87，88]参与PGCs的形成。这些因子(BⅧ2、BMP4、BⅧ8b)及其受体，和它们所涉及的信号通路在生殖细胞发育中的作用已在突变小鼠的模型上有了一定的研究[74，89]。转录因子Ifitm3(fragilis)在外胚层微弱表达，而BMP4增强它在邻近外胚层处的表达，这是生殖谱系建立的第一个信号【7】。之后，BMP4信号诱导上胚层中的B淋巴细胞诱导的成熟蛋白1(B-lymphocyteinducedmaturationprotein1，Blimpl)的表达，且Blimpl阳性细胞数量不断增加，研究表明这些阳性细胞为PGC的前体细胞【15，90]。Blimpl基因缺失小鼠的PGCs特化在早期阶段即受阻，产生的PGCs样细胞数量少且无正常的迁移能力，说H强Blimpl为PGCs特化所必需 上海交通大学博士学位论文的关键因子【15，91，92】。原肠形成后不久，生殖细胞不再受BMP4的作用，一部分Ifitm3+细胞迁移至胚外中胚层，约7dpc时开始表达Dpp3a(stella、PGC7)，这一过程中，生殖细胞激活多能性基因!tIlPou5fl(Oct3／4)，0ct3／4表达于内细胞群、外胚层及PGCs，是维持生殖细胞存活的重要因子[14，93]，但其在体细胞的表达受到抑制[94]。PGCs迁移过程中，与影响其路径和转归命运的体细胞相互作用[50，95，96】。随着11．5dpc时PGCs迁移的完成，PGCs开始表达迁移后的生殖细胞标志物Ddx4(即Vasa、Mvh)[97]。生殖母细胞有丝分裂的停滞依赖于XY生殖腺中生殖细胞与体细胞的相互作用[2]。有研究表明，生殖细胞的减数分裂是自发的；也有报道认为这一过程可能受到来自体细胞的信号的诱导【98，99]。最近的研究表明，不论迁移后的PGCs进入有丝分裂还是停滞在减数分裂，均受维甲酸(retinoicacid，RA)的调节[100．105]。RA促进PGCs有丝分裂并增殖的作用可延续到13．5dpc。一定浓度的RA能够激活视黄酸激活基因8(stimulatedbyretinoicacidgene8，Stra8)的表达，使PGCs进入减数分裂。由于雄性生殖嵴中体细胞分泌的细胞色素P450酶(cytochromeP450family26bl，Cyp26b1)降解RA，从而阻止雄性PGCs进入减数分裂[30]。与之相反，雌性体内的Cyp26b1受抑制，其PGCs可进入减数分裂[103，106]。然而，不论受体的遗传性别如何，移植至异位(如肾上腺)的PGCs均可进行减数分裂[107]。二、ES细胞分化为生殖细胞ES细胞是从囊胚的内细胞群分离出的多能性干细胞，可在体内分化为包括生殖细胞在内的几乎所有类型的细胞[108．111]。ES细胞导入植入前的囊胚后，可整合于其中并参与正常的胚胎发育，而不产生肿瘤。基于这一点，ES细胞为再生医学的研究提供了独特的视角。目前，在体外研究ES细胞向生殖细胞的分化潜能主要采用两种方法，即单层细胞贴壁培养和制备类胚体(embryoidbody，EB)。由于胚胎干细胞在体外自发分化仅能产生少量的生殖细胞，目前，研究者大多通过向培养体系中添力NBMP4【112-116]、RA[117-119]等以提高其分化效率。此外，由于ES细胞与PGCs拥有一些共同的标志物，使二者的鉴别遇到一定的困难。研究人员需要在实验中根据生殖细胞在迁移前、中、后以及减数分裂时期表达的基因或蛋白，结合细胞的形态、功能对其进行鉴别与分析。78 上海交通大学博士学位论文2．1ES细胞分化为雌性生殖细胞HUbner等[120]在无LIF和饲养层的情况下，将带有报告基因Oct4的ES细胞进行单层培养，ES细胞在表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)、胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)等的作用下，发育形成了包含有卵母细胞的卵泡样结构(oocyte．1ikecells，OLCs)。这一结构表达Oct4、Vasa，继续培养至3~4周时表达减数分裂的标志物Dmcl、联会复合体蛋白3(synaptonemalcomplexprotein3，Scp3)等。尽管作者未对所得到卵母细胞的受精能力作进一步的检测，但在第6周时观察到了与囊胚极为相似的结构，提示这些细胞自发地进行了孤雌生殖。该研究首次证明体外培养的ES细胞可发育为可进行减数分裂的卵母细胞，这些细胞募集其周围的细胞形成卵泡样结构，并可发育至囊胚，说明来源于ES的细胞在体外有FBS存在的情况下具有形成配子的潜能。但由于效率较低，这些卵母细胞的发育潜能尚待探讨。利用新生小鼠睾丸来源的条件培养基培养ES细胞，同样可以获得卵泡样结构【121，122]。Lacham·Kaplan[121]将ES细胞制备成EB，后者在上述条件培养基中发育形成了卵母细胞样结构。这些卵母细胞外围包围着1～2层扁平细胞，而无透明带，但这一结构可表达卵母细胞特异的标志物如Figct、ZP．3等。从而说明，ES细胞在培养的过程中，一部分细胞可在生殖细胞来源的条件培养基中被编程为生殖细胞。作者认为由睾丸生殖细胞而来的培养基中含有对卵母细胞形成起重要作用的生长因子，然而这一培养基在很大程度上具有不可控性，卵母细胞的发育潜能同样需要评估。Aflatoonian[122]等用类似的条件培养基同样得到了生殖细胞，检测到卵母细胞的发育以及减数分裂后的标志物。Clark【123]等将ES细胞制备成EB，应用PCR、免疫组织化学染色，发现EB中的细胞表达生殖细胞不同发育阶段的标志物，如Vasa，Dazl，Scp3等。这一结果提示我们，人雄性和雌性ES细胞均可自发地形成可进行减数分裂的生殖细胞，但作者未观察到有重组节的联会复合体，故认为体外培养时，人生殖细胞的减数分裂可能像体内的一样，需要体内微环境中生殖细胞的相关因子和／或体细胞的共同参与。而Novak等[124]应用体内生殖细胞减数分裂前期I时期的标志物评价由ES细胞分化得到的生殖细胞所处的发育阶段，发现Sop3表达于生殖细胞样细胞，但其在细胞核中的分布异常，且与同源染色体相分离。其他的减数分裂标 上海交通大学博士学位论文志性蛋I兰tScpl、Scp2、基质抗原3(stromalantigen3，Sta93)，REC8(meioticproteinsimilartotherad21cohesins)以及SMCl(structuralmaintenanceofchromosomes．1)不表达。荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)分析结果显示，Scp3+细胞中无联会同源染色体，而体细胞中的染色体正常。减数分裂相关的重要蛋白的表达缺失及减数分裂时染色体的异常，提示fljES细胞而来的生殖细胞样细胞不能进入减数分裂并进行正常的发育。生殖细胞的发育受其所处微环境的精密调控，其中卵巢中的颗粒细胞、睾丸中的支持细胞、间质细胞等体细胞发挥着重要作用。为此，有研究者通过体细胞与ES细胞共培养的途径，对后者进行诱导分化。Qing等先将ES细胞制备成EB，4天后将其与卵巢颗粒细胞共培养，在体外获得了表达卵母细胞标志GDF9、ZPl．3的卵母细胞样结构[125]。无独有偶，Richards等【119】比较了不同培养体系对人ES细胞向生殖细胞分化的影响，发现猪卵巢成纤维细胞及其条件培养基能明显提高人ES细胞向生殖细胞分化的效率。2．2ES细胞分化为雄性生殖细胞Toyooka等【112】首次将带有Vasa报告基因的ES细胞，在无白细胞抑制因子(1eukocyteinhibitoryfactor,LIF)的情况下进行悬浮培养制备EB。EB在贴壁后自发地表达Vasa，提示EB中存在具有迁移后的PGCs样细胞。将流式细胞仪(FACS)分选所得的Vasa+细胞，与野生型胚胎的雄性生殖嵴细胞相混合，移植至无生精功能的成年小鼠的睾丸中，这些细胞可形成生精小管样结构，且参与并完成了精子发生过程。有趣的是，作者发现加入BMP4可在24d',时内促进EB表达Vasa+的细胞。尽管未检测所得精子的受精能力，这一研究表明EB可自发或经诱导产生迁移后的PGCs样的细胞和生殖细胞，这些细胞可在睾丸的微环境中聚集形成生精小管。Geijsen等[126]也报道-r4,鼠ES细胞自发产生雄性PGCs，同样是通过制备EB实现的。不仅如此，他们还从EB中检测并分离出了单倍体细胞，将它注射入卵母细胞，产生囊胚样结构，但用这种方法分离出的单倍体细胞并不像精子，也不确定它们是否能够参与、完成胚胎发育过程。但这项研究至少表明，来于ES细胞的雄性PGCs可自发形成减数分裂后期的细胞，后者具有一定的受精能力。Nayemia等【127]贝0首先报道了从小鼠ES细胞获得的雄性配子能成功产生子代。 上海交通大学博士学位论文他们将报告基因Stra8转染到ES细胞中，之后又在单层培养体系中转染了protaminel(Prml)报告基因，不断用RA处理细胞，将分离出的Stra8+、Prml+细胞注射入卵子中，得到的受精卵植入假孕小鼠的子宫内，诞生了7只带有Prml报告基因的子代，但这些子代存在生长缺陷，在出生后的5个月内死亡。这是第一篇关于小鼠ES细胞分化形成的单倍体细胞具有受精能力，并可产生子代的报道。最近，日本研究人员【128]]成功将小鼠ES细胞转化为PGCs，并将其植入不能正常产生精子的实验鼠体内，PGCs在此受体发育产生了正常形态的精子，这些精子能够使卵子受精，并最终培育出健康且具生殖能力的子代。这项突破性研究将有助于阐明人类生殖细胞的发育过程，揭示不育症的病因并推动其治疗，有望为男性不育者带来福音。但这一技术应用于人类之前，还需要克服技术及伦理难题，仍有很长的路要走。2．3ES细胞分化为雌、雄性生殖细胞Clark【123]和Kerkis[118】和Feng等[129]对由一个培养体系中同时获得卵子和精子做了报道。KerldsA等将培养的雄性ES细胞制备成EB培养3—4天后，加入RA诱导其分化，免疫荧光、RT-PCR等检测到EB中生殖细胞相关标志物Vasa、Dazl、Zp-3、Scpl、Sop3、Acmsin、FE-J1等的表达，随着RA作用时间的延长，观察到了精子样结构，之后，在同一培养皿中发现了卵母细胞样结构，说明RA刺激后用分化培养基培养的EB可向两性分化。尽管诱导形成的雄性、雌性生殖细胞能进行减数分裂，但得到的精子无运动能力，且卵子的形成时间比精子要久些，它们的功能有待于进一步研究。冯立新的研究小组则获得了游动的精子，发现获得的卵子启动了孤雌生殖。除了通过EB形成和分化的手段，结合BMP4和／或RA的作用诱导ES细胞分化外，研究人员还通过其他技术研究ES细胞向生殖细胞的分化。Feng等[129]采用转基因技术直接在体外诱导小鼠ES细胞转化为生殖细胞。作者通过瞬时过表达生殖细胞特异RNA结合蛋白的基因——-Dd基因，在体外将ES细胞同时诱导出了卵子和游动的精子，而Dazl基因敲减导致生殖细胞标记物基因的表达降低，这其中包括Stella，Vasa和Prdml等基因。从而认为Dazl基因是控制生殖细胞分化的重要基因。几乎同时，斯坦福大学的Pera【130]所在的研究小组通过沉默和过表达生殖细胞特异的Daz基因家族(DAZL，DAZ和BOULE)，将人 上海交通大学博士学位论文ES细胞在体外诱导出PGCs，后者可进入减数分裂并得到单倍体。这些结果表明，Daz基因家族在ES细胞向生殖细胞分化的过程中发挥着重要作用。三、iPS细胞分化生殖细胞2006年日本科学家Yamanaka[131]乖U用病毒载体将四个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c．myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到了类似胚胎干细胞的一种细胞类型——iPS细胞。iPS细胞细胞具有多能性和自我更新的能力，其在生物学特性、类胚体形成、干细胞特征性基因表达、DNA甲基化和染色体状态等方面，与ES细胞非常类似[132．135]。目前已成功获得小鼠和人的不同体细胞来源的iPS细胞，并不断探索提高其重编程效率和安全性的有效方法[135．161]。利用iPS技术能够获得病人或疾病特异的多能性干细胞，此外，它不仅能避免移植中的免疫排斥问题，也绕开了人ESCs研究带来的伦理学问题，被视为最有希望运用到再生医学的重要资源。近年来，陆续出现将iPS细胞诱导为生殖细胞的报道。将iPS与胎儿生殖腺间质细胞共培养[162]，可促进iPS向生殖细胞分化，但所得生殖细胞的印记基因未能像PGCs正常发育时出现印记基因H19的去甲基化，作者认为重编程改变了iPS的表观遗传修饰，进而影响了其发育、分化。Sarita等[164]在BMPs的作用下，将由胎儿、成年体细胞重编程而来的iPS细胞在体外进行诱导，5％的iPS细胞分化为PGCs。过表达Daz基因家族成员DAZL，BOULE和DAZ后，PGCs可进入减数分裂，表达减数分裂相关蛋白Scp3、中心粒蛋白A(CENtromericProteinA，CENP．∞。不仅如此，经FACS分析，得到的细胞可完成减数分裂并表达顶体蛋白(acrosin)。作者认为，iPS细胞可在一定条件下经体外诱导分化，完成减数分裂并形成单倍体，而且，与人ES细胞相比，相同条件下iPS细胞更易自发地向生殖细胞分化。人角质细胞、脐带血细胞来源的iPS细胞同样可诱导分化为生殖细胞[z65]。iPS细胞培养3周后加入RA，3周后FACS检测到VASA+／SSEAl。细胞，说明iPS细胞被诱导形成了生殖细胞，有趣的是，在这一过程中，检测到了睾丸支持细胞及间质细胞的标志物，说明在体外重建出了类似睾丸的微环境，为生殖细胞的发育提供了有利条件。之后，作者收集CD9+／CD49fH／CD90"／SSEA4。细胞，发现它们进一步分化，表达Scp3、yH2AX等减数分裂相关基因，并产生单倍体。表观遗传修饰检测显示，至分化第10周时，印记基因H19的甲基化呈精子样模式， 上海交通大学博士学位论文进一步说明了所得生殖细胞的分化能力。在小HiPS细胞研究方面，Masanori等[163]将Oct4，Sox2，Klf4转导入肝细胞，制备成的iPS细胞，在无饲养层条件下，用特定的培养基培养，观察到了迁移后PGCs样细胞。而且，iPS细胞与能产生BMP4的M15细胞共培养，其向生殖细胞分化的效率更高。由iPS细胞而来的EB在RA的诱导下，可形成圆形的类似卵母细胞样的结构。这些研究表明，不同来源的体细胞经过重编程形成iPS细胞后，可在体外经诱导分化，具有向生殖细胞发育的潜能，形成卵母细胞或精子样结构，从而为治疗由生殖细胞异常而导致的不育症患者带来了新的希望。四、展望综上所述，ES细胞、iPS细胞均可在一定条件下，在体外经诱导分化形成生殖细胞，从而为生殖细胞发育及其调控的研究提供良好的体外模型。然而，依然存在一些需要解决的问题：如①如何优化体外培养条件，更好地在体外营造生殖细胞发育的微环境，提高诱导效率；②促进生殖细胞减数分裂完成的方法与途径；③所产生配子的受精能力的提高；④诱导、分化过程中，调控细胞在表观遗传修饰方面发生的变化；⑤提高重编程效率，降低诱导iPS细胞的致癌性等。以上问题都有待于进一步研究和探索。参考文献1．vaildeLavoir,M．C．，eta1．，Germlinetransmissionofgeneticallymodifiedprimordialgermcells．Nature，2006．441(7094)：P．766-9．2．McLaren,A．，Primordialgermcellsinthemouse．DevBiol，2003．262(1)：P．1-15．3．Donovan，P．J．andM．P．deMiguel，Turninggermcellsintostemcells．CurrOpinGenetDev,2003．13(5)：P．463-71．4．Soto-Suazo，M．andT．M．Zorn，Primordialgermcellsmigration：morphologicalandmolecularaspects．AnimalReproduction，2005．2(3)：P．147．160．5．DeFelici，M．，eta1．，Experimentalapproachestothestudyofprimordialgermcell矗neageandproliferation．HumReprodUpdate，2004．10(3)：P．197-206．6．Ginsburg，M．，M．H．Snow,andA．McLaren,Primordialgermcellsinthemouseembryoduringgastrulation．Development，1990．110(2)：P．521-8。 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上海交通大学博士学位论文129．130．131．132．133．134．135．136．137．138．139．140。141．142．143．pathwayinculturebypluripotentstemcells．Cell．146(4)：P．519-32．Yu，Z．，eta1．，Dazlpromotesgermcelldifferentiationfromembryonicstemcells．JMolCellBiol，2009．1(2)：P．93-103．Kee，K．，eta1．，HumanDAZL，DAZandBOULEgenesmodulateprimordialgerm-cellandhaploidgameteformation．Nature，2009．462(7270)：P．222—5．Takahashi，K．andS．Yamanaka，Inductionofpm，．勿D纪，zfstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors．Cell，2006．126(4)：P．663-76．Zhao，X．Y，eta1．，iPScellsproduceV觑6彪micethroughtetraploidcomplementation．Nature，2009．461(7260)：P．86-90．Boland，M．J．，eta1．，Adultmicegeneratedfrominducedpluripotentstemcells．Nature，2009．461(7260)：P．91-4．Kang，L．，eta1．，iPScellscansupportfutt-termdevelopmentoftetraploidblastocyst-complementedembryos．CellStemCell，2009．5(2)：P．135·8．Wemig，M．，eta1．，InvitroreprogrammingoffibroblastsintoapluripotentES-cell-likestate．Nature，2007．448(7151)：P．318-24．Maherali，N．，eta1．，DirectlyreprogrammedfibroblastsshowgfDbalepigeneticremodelingandwidespreadtissuecontribution．CellStemCell，2007．1(1)：P．55-70．Takahashi，K．，eta1．，Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors．Cell，2007．131(5)：P．861—72．Okita，K．，T．Ichisaka，andS．Yamanaka,Generationofgermline—competentinducedpluripotentstemcells．Nature，2007．448(7151)：P．313—7．Yu，J．，eta1．，Inducedpluripotentstemceillinesderivedfromhumansomaticcells．Science，2007．318(5858)：P．1917-20．Lewitzky,M．andS．Yamanaka,Reprogrammingsomaticcellstowardsp胁，勿。胞咒缈bydefinedfacWrs．CurrOpinBiotechnol，2007．18(5)：P．467—73．Nakagawa，M．，eta1．，Generationofinducedp觑，．勿otentstemcellswithoutMycfrommouseandhumanfibroblasts．NatBiotechnol，2008．26(1)：P．101-6．Mali，P．，eta1．，Improvedefficiencyandpaceofgeneratinginducedpluripotentstemcellsfromhumanadultandfetalfibroblasts．StemCells，2008．26(8)：P．1998．2005．Stadffeld，M．，eta1．，Inducedpm，．勿otentstemcellsgeneratedwithoutviral93 上海交通大学博士学位论文144．145．146．147．148．149．150．151．152．153．154．155．156．157．158．integration．Science，2008．322(5903)：P．945-9．Okita,K．，eta1．，Generationofmouseinducedpluripotentstemcellswithoutviralvectors．Science，2008．322(5903)：P．949—53．Shi，Y，eta1．，Acombinedchemicalandgeneticapproachfo，．thegenerationofinducedpluripotentstemcells．CellStemCell，2008．2(6)：P．525—8．Li，C．，eta1．，Germline-competentmouse—inducedpluripotentstemcelllinesgeneratedonhumanfibroblastswithoutexogenousleukemiainhibitoryfactor．PLoSOne，2009．4(8)：P．e6724．Okita，K．，eta1．，Amoreefficientmethodtogenerateintegration-freehumaniPScells．NatMethods．8(5)：P．409-12．Ebben，J．D．，eta1．，Introductiontoinducedpluripotentstemcells：advancingthepotentialforpersonalizedmedicine．WorldNeurosurg．76(3-4)：P．270-5．Kawamura,T．，eta1．，Linkingthep53tumoursuppressorpathwaytosomaticcellreprogramming．Nature，2009．460(7259)：P．1140-4．Singhal，N．，eta1．，Chromatin-RemodelingComponentsoftheBAFComplexFacilitateReprogramming．Cell．141(6)：P．943-55．Zhang，z．，eta1．，EfficientGenerationofFullyReprogrammedHuman谬scettsviaPolyc&tronicRetroviralVectorandaNewCocktailofChemicalCompounds．PLoSOne．6(10)：P．e26592．Eggenschwiler,R．andT．Cantz，Inducedpluripotentstemcellsgeneratedwithoutviralintegration．Hepatology,2009．49(3)：P．1048-9．Yu，J．，eta1．，Humaninducedpluripotentstemcellsfreeofvectorandtransgenesequences．Science，2009．324(5928)：P．797·801．Narsinh，K．H．，eta1．，GenerationofadulthumaninducedpluripotentstemcellsusingnonviralminicircleDNAvectors．NatProtoc．6(1)：P．78·88．Hu，K．，eta1．，Efficientgenerationoftransgene-freeinducedpluripotentstemcellsfromnormalandneoplasticbonemarrowandcordbloodmononuclearcells．Blood．117(14)：P．el09-19．Woltjen，K．，eta1．，Transgene-freeproductionofpluripotentstemcellsusingpiggyBactransposons．MethodsMolBi01．767：P．87-103．Jia，F．，eta1．，Anonviralminicirclevectorfo，．derivinghumaniPScells．NatMethods．7(3)：P．197-9．Zhou，H．，eta1．，Generationofinducedpluripotentstemcellsusingrecombinantproteins．CellStemCell，2009．4(5)：P．381-4．94 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上海交通大学博士学位论文致谢紧张而忙碌的研究生生活即将结束，值此论文搁笔之际，不禁感慨万千。这几年经历了很多，也收获了很多。有刚进学校时的喜悦，有接触实验时的期待，有遭遇困难时的迷茫、有失败时的沮丧，更有愈挫愈勇的历练⋯．．而更多的，是人生信念的坚定、知识面的拓展和能力的锻炼与提升。成长中的点滴随着时间的流逝渐行渐远，但这段经历将成为弥足珍贵的记忆，影响并激励着我继续前行。感谢为了我的成长和实验的顺利进行而付出辛勤劳动和心血的领导、老师、同学和家人!感谢我的导师徐晨教授。徐老师在学业上给予了我严格的教诲和悉心的指导，在生活上给予了无微不至的关怀和照顾。徐老师谦虚的品格、渊博的学识、敏锐的思维、严谨的治学态度深深地影响了我，使我终身受益，并将激励我不断进取。他务实的工作作风和对生殖医学研究事业孜孜不倦的追求精神给我留下了深刻的印象，令我由衷敬佩。我将牢记您的谆谆教导，努力地充实、提高自己，在今后的人生道路上不断进步。感谢尊敬的王一飞教授。王老师学识渊博，思维敏捷，他独特的人格魅力和豁达的胸襟深深地感染着我。他不仅与我们分享对人生真谛的反思与感悟，而且及时为我们答疑解惑，指点迷津。感谢我的老师兼师姐——夏小雨博士，她无私、耐心地向我传授实验技术和经验，实验中给我莫大的帮助和鼓励，生活中给我细致的关心和照顾。在实验设计、实施以及论文撰写的过程中，她倾注了大量的精力和心血，和我一起攻克了实验中的一个个难关，使本课题得以顺利完成。感谢王莉师妹，她在繁忙的实验之余，帮我完成了大量的动物实验和检测工作。感谢鲁梅格老师在实验物品领取、试剂订购等方面提供的便利；感谢胡燕琴老师在动物订购方面的帮助；感谢金一平老师在实验室财务管理方面给我提供的便利。几位老师在实验上给我鼓励，在生活中对我关怀备至，特别地感谢她(他)们! 上海交通大学博士学位论文冯京生、胡燕琴老师在组织切片的制作、染色及观察等问题上给予的指导，使我受益良多。郭强苏、刘悦两位老师在激光共聚焦显微镜使用、切片观察方面，秦石小老师在显微摄影方面，权艳梅老师在细胞培养方面给予了我指导与帮助，在此感谢他们!感谢组胚教研室／上海市生殖医学重点实验室的青年教师陈荪红、伍静文、潘艺青、武婷婷老师，以及已经毕业的鲍坚强、周中平博士、朱哗敏硕士，他们不断出谋划策，帮我完成实验。感谢实验室侯东省、张爱军、沈健、薛峰博士，李垄、薛珂硕士等，在这个温暖的大家庭里，大家真诚相待、团结互助、携手前进，共度的时光虽然短暂，却是一段美好的回忆。感谢上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科、上海市人类精子库李铮教授、刘平硕士在生精小管皮下重构合作研究中提供的帮助。感谢我的同窗好友王莹萍、李亚彭、刘婷、沈炜炜博士等，大家在实验方面相互鼓励，生活上互相关照，结下了深厚的情谊。感谢基础医学院科研办公室的方丽娟、朱雯佳、蔡霞等老师的辛勤劳动。感谢我的父母、弟弟，求学路上有你们始终如一的支持和陪伴。作为我坚强的后盾，无论成功和失败，不管顺境还是逆境，你们给我的永远是信心、勇气、力量和希望。衷心地感谢你们!
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