人退变髓核细胞老化信号通路的体外研究

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1、壕．初大·粤硬士学位论文万方数据人退变髓核细胞老化信号通路的体外研究万方数据AvitrostudyonsenescentpathwaysofhumandegenerativenucleuspulposuscellsDissertationSubmittedtoSoutheastUniversityFortheClinicalDegreeofMasterofMedicineBYShiHangSupervisedbySupervisedbyProfessor胁Xiao．taoSchoolofClinicalMedicalCollegeSoutheastUniversityMay

2、2014万方数据东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写。过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：垫日期：坐∥弓p东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相

3、一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容研究生签名：垃登)授权东南大学研究生院办理。El期：丝些；汐万方数据中文摘要人退变髓核细胞老化信号通路的体外研究东南大学医学院研究生：史航导师：吴小涛教授目的：探索人退变髓核细胞复制性老化和应激诱导过早老化的信号通路。方法：1、体外培养人正常髓核细胞系(ScienCeU4800)。连续性l：2传代、培养(理论上可传至P15代)，诱导髓核细胞复制性老化。2、取Pl代髓核细胞按lxl06个／孔接种于六孔板，按双氧水浓度(50ttmol／L、100pmol／L、150pmol／L)和作用

4、时间(30min、lh、2h)分组，氧化应激诱导髓核细胞过早老化。3、分别对步骤l中的各代细胞及步骤2中的各组细胞行显微镜观察髓核细胞形态、SA．p-C,al染色计数细胞老化率、PI染色流式细胞仪检测Gl期细胞比例、AnnexinV-FITC／PI染色流式细胞仪定量细胞凋亡率，制备两组髓核细胞老化模型。(注：因目前尚无髓核细胞老化模型的公认标准，本研究中拟定老化率≥80％、G1期细胞兰80％、凋亡率茎10％的造模组为合格的髓核细胞老化模型。)4、取Pl代髓核细胞(老化阴性对照组)、复制性老化模型、应激诱导的过早老化模型3组细胞，采用实时定量RT-PCR检测3组细胞p53、p

5、21、p16、pRb的表达含量。结果：1、在诱导髓核细胞复制性老化过程中，随着细胞传代次数的增加，髓核细胞形态逐渐由类圆形、星形、短梭形向长梭形、不规则形等转变，细胞体积逐渐增大、胞质变脆、胞浆空泡化明显。SA．B．Gal染色计数髓核细胞老化率、流式细胞仪检测Gl期细胞比例、细胞凋亡率均逐渐增加，传至P12代时三者比例分别为82．1％、84．7％、9．8％，差异与正常P1代髓核细胞相比有统计学意义(P<0．05)。2、在氧化应激诱导髓核细胞过早老化过程中，随着双氧水浓度的增加、作用时间的延长，细胞形态逐渐由类圆形向长梭形转变，细胞体积增加、胞浆空泡化明显。SA-p．Gal染

6、色计数髓核细胞老化率、流式细胞仪检测G1期细胞比例、细胞凋亡率均逐渐增大，且100pmol／L双氧水作用P1代髓核细胞2h后三者比例分别为82．3％、83．6％、8．6％，差异与正常P1代万方数据东南大学硕士学位论文髓核细胞相比有统计学意义(P0．05)。在应激诱导的过早老化模型中，p53、p21、p16、pRb的表达量较

7、对照组均有所增加，但p16、pRb表达量较p53、p21增加明显，差异较对照组有统计学意义(P0．05)。结论：l、通过连续性传代培养人正常髓核细胞系(ScienCdl4800)，成功建立髓核细胞复制性老化模型(P12代髓核细胞)；2、通过100pmol／L双氧水作用于P1代髓核细胞2h，成功建立应激诱导的髓核细胞过早老化模型；3、在髓核细胞复制性老化中，老化信号通路以p53-p21-pRb途径为主；4、在应激诱导的髓核细胞过早老化中，老化信号通路以