分区式组织工程脊髓修复大鼠脊髓损伤与抑制神经组织的细胞凋亡研究

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1、万方数据苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名．译四日期：山"．1，万方数据苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学

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3、导管(partition—typetubescaffold，PtTS)联合骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)组建分区式组织工程脊髓，在大鼠T8脊髓5mm全横断损伤模型中的修复效果。方法：I、体外实验1．体外培养、传代大鼠来源的绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)标记的BMSCs。2．以壳聚糖和甲壳素为主要原料制备PtTS和单通道导管(hollowtubescaffold，HTS)。3．制备组织工程脊髓导管浸提液，用于BMSCs体外培养，CCK8法检测BMSCs与组织工程脊髓导管材料

4、的生物相容性。4．光镜观察BMSCs在PtTS上的生长情况。Ⅱ、体内实验1．实验动物分组：SD大鼠随机分为6组，其中HTS组、PtTS组、HTS+BMSCs组和PtTS+BMSCs组，分别采用不同的方式来桥接修复大鼠T8脊髓节段5mm缺损；另设缺损组和假手术组作为对照组；分笼饲养12M后进行各项指标观察。2．行为学检测：各组大鼠分别于术前、术后1w、2w、4w、6w、8w、10w、12w、6M、9M、12M进行BBB行为学评分和CatWalk自动定量步态分析。3．运动诱发电位(motorevokedpotentials，MEPs)检测：利用全功能肌电图诱

5、发电位仪，将刺激电极分别置于大脑皮层或损伤下段(约T10节段)皮下，记录电极置于腓肠肌内，测定各组大鼠MEPs，对潜伏期和振幅进行统计学分析。4．红核脊髓束(rubrospinaltract，RST)顺行示踪：取材前2w利用脑立体定万方数据中文摘要分区式组织工程脊髓修复大鼠脊髓损伤与抑制神经组织的细胞凋亡研究位仪将Fluororuby(FR)注射入红核中心部位，观察各组脊髓损伤区域RST生长情况。5．免疫荧光组织化学染色：取C4到L4节段脊髓组织进行5-HTlA和NF免疫荧光组织化学染色，观察神经纤维再生和BMSCs分化情况；计算各组距离损伤中心不同节段

6、脊髓中的阳性神经纤维数目与假手术组的比例，进行统计学分析。6．Westernblot检测：取各组脊髓损伤中心至头端和尾端均为3mm范围内的脊髓组织，提取蛋白检测5-HTlA和NF蛋白的表达情况。7．电镜观察：取各组脊髓损伤中心的再生组织进行电镜观察，计算有髓神经纤维的数目和髓鞘厚度并进行统计学分析。结果：I、体外实验1．BMSCs的体外培养：对BMSCs进行体外培养，传代6次后，荧光显微镜下观察其GFP荧光标记率仍达90％左右。2．组织工程脊髓导管的制各：成功制备PtTS和HTS。3．BMSCs与组织工程脊髓导管的相容性检测：CCK8法检测细胞增殖曲线，

7、结果显示随培养时间延长，BMSCs数量持续增多，第3d到达平台期；光镜观察，BMSCs在导管腔面黏附生长，状态良好。Ⅱ、体内实验1．术后动物一般情况观察：术后12M除假手术组外，其余各组大鼠后肢肌肉有不同程度的萎缩，脊柱有不同程度的弯曲，其中PtTS+BMSCs组和HTS+BMSCs组大鼠相对其余各组较好。2．行为学检测：(1)BBB评分：术后各手术组大鼠评分均降至0分，然后逐步上升；从术后10w到12M，PtTS+BMSCs组和HTS+BMSCs组明显高于HTS组、PtTS组和缺损组，差异有统计学意义；后3组间无显著性差异。(2)步态规律的规律指数：术

8、后各手术组均明显下降，2w后开始缓慢上升；PtTS+BMSCs组在8w后明显高于