分子标记技术在甘蓝品种鉴定及未熟抽薹性状研究中的应用

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1、扬州大学硕士学位论文分子标记技术在甘蓝品种鉴定及未熟抽薹性状研究中的应用姓名：刘冲申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：葛才林;薄天岳20060501刘冲：分子标记技术在甘蓝品种鉴定及未熟抽薹性状研究中的应用三摘要甘蓝起源于地中海沿岸，包括结球甘蓝、皱叶甘蓝、红甘蓝、羽衣甘蓝、花椰菜、青花菜、抱子甘蓝、球茎甘蓝等多个变种，现已成为世界许多国家的主要蔬菜。目前，分子标记技术己广泛应用于多种作物研究，但在甘蓝上的应用研究刚刚起步，本课题以甘蓝为材料，研究其分子标记技术及其应用，主要开展以下三部分工作：第一部分是以结球甘蓝基因组DNA为模板，优化获得适用于八种甘蓝

2、类蔬菜的RAPD、SRAP、ISSR技术体系；第二部分是利用SSR、RAPD技术鉴定甘蓝杂交种“早夏16”、“夏光”的纯度，利用SRAP、RAPD技术鉴定甘蓝杂交种“争春”、“寒光2号"的纯度，并建立相应的指纹图谱；第三部分是应用BSA方法研究春结球甘蓝未熟抽薹性状，寻找与春甘蓝未熟抽薹基因连锁的RAPD标记。主要结论如下：1．甘蓝RAPD、SRAP、ISSR技术体系的优化和初步应用优化得到反应总体积为201xl的甘蓝RAPD体系是：25mmol／LMgCl22．09l+10×PCRBuffer2．0m+10mmol／LdNTPO．59l+5U／lxlTaqE0．

3、5pl+20ng／glPrimer1．5t．tl+10ng／gl模板DNA3pl+灭菌双蒸水10．51．tl。适宜的RAPD扩增程序为：94。C5min；94。C1min，37。Clmin，720C1．5min(40cycles)；72。C10min。优化得到反应总体积为20p．1的SRAP反应体系是：25mmol／LMgCl22．O斗l+10xPCRBuffer2．0m+10mmol／1dNTP0．4m+5U／斗lTaqE0．29l+30ng正向Primer+30ng反向Primer+25ng模板DNA，其余体积以灭菌双蒸水补齐。适宜的SRAP扩增的程序为：94

4、。C5mim94。Clmin，35。Clmin，72。C1．5min(5cycles)；94"Clmin，48℃lmin，72℃1．5min(35cycles)；72。C10min。优化得到反应总体积为20va的ISSR反应体系是：25mmol／LMgCl21．8txl+10×PCRBuffer2．09l+10mmol／LdNTP0．49l+5U／ptlTaqE0．39l+30ngPrimer+30ng模板DNA，其余体积以灭菌双蒸水补齐。适宜的ISSR扩增程序为：94。C5min；94。Clmin，50。Clmin，720C1．5min(40cycles)；72

5、6C10min。经优化的RAPD、SRAP、ISSR反应体系和扩增程序对八种甘蓝类蔬菜均适用，扬州大学硕士学位论文并且可分别利用RAPD引物S18、SRAP引物组合M3．E5和M4．E5、ISSR引物844将八种甘蓝类蔬菜一一区分。2．分子标记方法鉴定甘蓝杂交种纯度以“夏光”、“早夏16”、“争春”、“寒光2号”四杂交种及其各自亲本的基因组DNA为模板组合，通过RAPD方法成功筛选出能鉴定各杂交种纯度的引物，其中能鉴定杂交种夏光的引物为S15、$42和S147，能鉴定杂交种早夏16的引物为$42、$78和$88，能鉴定杂交种争春的引物为$42、8103和S193，

6、能鉴定杂交种寒光的引物为$42、$89、S151，并将引物$42对四组材料扩增出的特异的RAPD指纹图谱转变为相应的数字指纹。3．舂结球甘蓝未熟抽薹性状RAPD分子标记研究经260个RAPD引物筛选，获得4个能扩增出甘蓝未熟抽薹基因连锁标记的候选引物，4个引物对F2代分离群体扩增产生5个连锁标记，单个标记的连锁距离不同，其中最近达8．58cM。选择遗传距离较近的三个标记进行测序，根据三标记的大小和引物来源将其分别命名为$97—392、U16-446和U16—562。对三序列进行比较分析发现，三者之间不存在较大的相似性，且在GeneBank中末搜索到序列相同的DNA

7、片段或基因。关键词：甘蓝类蔬菜；结球甘蓝；RAPD；SRAP；ISSR；体系优化；区分；杂交种；SSR；鉴定；指纹图谱：春甘蓝；未熟抽薹；BSA；连锁标记；序列；●‘I刘冲：分子标记技术在甘蓝品种鉴定及未熟抽薹性状研究中的应用三ApplicationofMolecularMarkerTechnololgYonIdentificationofCabbageVarietiesandStudyofCabbageImmature-boltingCharacteris“csAbstractBrassicaoleraceaL．isoriginatedfromMedseacoa

8、st，it