致急性纤维肉瘤的缺陷型j亚群禽白血病病毒肿瘤基因的鉴定

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1、山东农业大学博士学位论文致急性纤维肉瘤的缺陷型J亚群禽白血病病毒肿瘤基因的鉴定姓名：陈浩申请学位级别：博士专业：预防兽医学指导教师：崔治中20120615山东农业人学博一l：学位论文中文摘要根据致瘤机制的不同，禽白血病／肉瘤病毒群各成员病毒被划分慢性转化型病毒和急性转化型病毒两类。慢性转化型病毒通过插入启动机制间接激活细胞原癌基因(c．onc)而引发肿瘤，潜伏期较长，一般超过90天；而急性转化型病毒则是通过直接启动自身基因组中携带的病毒肿瘤基因(v．onc)而导致急性肿瘤的形成，潜伏期一般仅在数周之内(FadlyandNair，2008

2、)。禽ALV．J的原型毒株HPRS．103是一种复制完整型病毒，其基因组中不含有任何病毒致瘤基因，在机体内不能快速诱发肿瘤的形成，在体外也不能转化鸡骨髓细胞(Payneeta1．，1992)。而在1993年，Payne等从该株病毒感染的表现有髓细胞瘤的实验室病鸡中分离到了数株携带有肿瘤基因v-myc的急性转化型病毒，这些病毒大多可以转化体外的骨髓细胞，在鸡体上可导致多种急性肿瘤的发生，如髓细胞瘤、肾胚细胞瘤及肾腺瘤等。而其中的966株则得到了较为详尽的研究(Payneeta1．，1993)。2000年，Venugopal等从自然感染J亚

3、群病毒的患有成红细胞性白血病的鸡群中分离到若干株含1，．myc的急性病毒，它们不仅可以诱发急性成红细胞增多病，而且还能导致髓细胞瘤和其他肿瘤的形成(Venugopaleta1．，2000)。Fujinami肉瘤病毒(FSV)于1914年从日本分离出来(Fujinarniandlnamoto，1914)，起初曾认为它和带有v-src肿瘤基因的劳斯肉瘤病毒(RousSarcomaVirus，RSV)是同一病毒的不同毒株，后来经序列分析发现它是完全不同的另一种带有v-fps肿瘤基因的急性缺陷型病毒(ShibuyaandHanafusa，198

4、2)。此外，PRCII是一株从自然发病鸡中分离的在5'-fps端缺失1020个核苷酸的此类型毒株，它转化细胞能力及致肿瘤能力稍弱(Carlbergela1．，1984；Huangeta1．，1984)。近年来，我们发现在国内爆发该病的鸡群中出现了急性肉瘤病例，病例组织切片法●检测表明其为典型纤维肉瘤，通过病毒分离试验确定病料中含有ALv．J(刘绍琼等，2011)。肉瘤组织研磨滤过液及其接种过的第一代DF细胞上清，在接种1日龄SPF鸡和817肉杂鸡后，可以在9天内复制出相同的纤维肉瘤(李传龙等，2012)。因此，我们怀疑其中除了含有完整复

5、制型的ALv-J外，很可能还存在一种可以引发快速致瘤的携有某种病毒肿瘤基因(v．onc)的缺陷型病毒。敏急性纤维肉痈的缺陷型J驱群禽[J血病病毒肿瘤基因的鉴定本研究课题初步探究了缺陷型病毒在体外CEF细胞培养中的生物学活性：提取病料中的病毒RNA和前病毒DNA，使用PCR法筛选到相关v．011c；然后制备针对该基因所编码蛋白的特异性抗血清，建立免疫荧光方法、免疫组化法分别对感染细胞中的病毒抗原、肉瘤组织切片进行检测：构建含有该肿瘤基因的缺陷型病毒的全基因组质粒，拯救分子克隆化病毒，回归动物复制病征，从而在分子和蛋白质两个水平上佐证缺陷型

6、病毒是造成急性纤维肉瘤的主因。为了观察肉瘤病料中缺陷型病毒在体外细胞培养中的增殖能力，分别将肉瘤组织滤过液及其感染后的细胞第1代毒、第2代毒接种相同的三组试验鸡只，结果发现第l代细胞毒同肉瘤研磨液具有相似的致瘤能力，但第3代细胞毒的致瘤速度及诱发鸡只出现肿瘤的比例则明显下降，这表明肉瘤中存在的缺陷型病毒粒子在体外CEF细胞培养过程中，产生的子代病毒粒子会逐渐减少，结合其不能引起CEF出现细胞病变效应的现象，我们推测该类缺陷型病毒很可能不适应在CEF上生长。使用PCR方法，我们扩增到了复制完整型ALV-J病毒粒子的完整基因组(命名为SDl

7、005)，同国内外其他12个J亚群毒株比对发现，它与引发慢性髓细胞瘤和血管瘤的毒株JS09GY6(Wueta1．，2010)具有相似的基因组结构，且整体核酸同源性高达97％，与其它毒株相比，亦没有显著的基因缺失或突变。而且，其基因组结构中并不含有任何病毒肿瘤基因，与J亚群病毒原型株HPRS一103同属于完整复制型病毒，再结合禽白血病／肉瘤病毒致瘤机制(FadlyandNair，2008)，可以排除SDl005是导致这种急性肿瘤形成的原因。随后，使用多对扩增不同肿瘤基因嵌合体分子的引物，我们确定了数个含有v-fps肿瘤基因的缺陷型基因组(

8、Fu．Jl-5)，其结构特征为：5’-R·U5一／xgag-fps．Ae?lv．U3．R．3’或5’一R—U5一Agag-fps—Ap01．／Xenv-U3一R-3’。在etlv基因水平上，Fu-Js同SD