禽白血病病毒b、e和j亚群基因芯片检测方法建立

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1、摘要IHI{illNllllmlllHfllltllBllllllIY2143893近年来鸡淋巴白血病(AL)一直危害着我国的养鸡业，已成为影响我国蛋鸡业的第一大疫病。由于常规实验室检测方法费时费力，进口ELISA试剂盒价格高昂且准确率并不理想，所以急需一种快速、灵敏、准确、高通量的检测方法来预防和控制AL发生和传播。本研究基于多重PCR技术，建立禽白血病病毒(ALV)的B、E、J亚群的基因芯片分型和检测方法。根据NCBI已收录的ALV三个亚群的参考毒株cDNA序列，在各亚群特异性基因突变区，两端选取其保守区域，设计合成三个亚群的通用上游引物1条，以及B、E亚群的通用

2、下游引物和J亚群下游引物各l条，将上述引物用Cy3标记，建立多重PCR体系；参考目的序列内部的三个亚群各自的保守区域，选择亚群之间基因突变位点多的区域，设计5条寡核苷酸探针，合成过程中在每条探针的5’端先加入若干个碱基T’使探针长度达到35ma"左右，再进行氨基化修饰，将合成好的探针点制在醛基化玻璃基片上，制作寡核苷酸探针基因检测芯片；以寄主细胞DFol中提取传代ALV的eDNA，以及合成NCBI收录的各亚群参考毒株的cDNA序列作为检测模板，利用Cv3标记的PCR扩增产物，与基因芯片进行杂交反应，扫描结果。对基因芯片进行特异性、灵敏度实验，并对50份临床样品进行检测

3、。经杂交反应后，芯片能够准确检测并分型三个亚群的参考毒株，其检测灵敏度能够达到102个基因拷贝，能够同时检测到三个亚群参考毒株的多重PCR产物，且与禽类常见的四种病毒均无交叉反应。对临床样品检测的结果与ELISA抗体检测结果相比符合率高。本研究结果证明，基因芯片技术是一种有效地对ALV的B、E和J亚群进行检测和分型的方法，且具有较高的特异性和灵敏度，为今后在临床应用中快速鉴别诊断ALV等免疫抑制病提供可行性。关键词：禽白血病病毒：亚群；基因芯片；多重PCR；寡核苷酸Developmentofagenechipassayforthedetectionofavianleu

4、cosisvirussubgroupsB，EandJAuthor：YueZhangMajor：MicrobialandBiochemicalPharmacyAdvisor：Prof．JiaxinWang；BingYangAbstractAvianLcukosis(AL)hasbeenharmingpoultryhusbandryinrecentyears，andhasbecomeathefirstbigindustrydiseaseofeggchickeninourcountry．Sincethecommonmethodsoflaboratorywastetimean

5、denergy，andtheimportedELISAkitwasexpensive，arapid，sensitive，accurate，highthroughputtestmethodforpreventionandcontrolofALVisurgentlyrequired．Inthissmd％agenechipassayWasdevelopedtodetectavianleucosisvirussubgroupsB，EandJbasedonthespecificgenefragmentamplifiedbymultiplexPCR．Byaligningmulti

6、plesequencesofALVsubgroupsB，EandJinGenBank，aconservedgenesegment、ⅣimmultipleinternalsitevariationsWaschosenasdetectiontarget．OneforwardprimerforsubgroupsB，EandJ，onereverseprimerforsubgroupsBandE，andonereverseprimerforsubgroupJweredesignedtoamplifythetargetgeneinthethreesubgroupsofALV．Th

7、eprimersCy3一labeledwereusedtoamplifythetargetgenefragmentsfromthetemplateDNAbymultiplexPCR．Fiveoligonueleotidesfromtheinternalvariationsofthetargetgeneweresynthesizedandprintedontheamino—modifiedslidesastheprobes．Inordertomaketheprobelengthtobe35mer,weaddseveralbasesTandmakethe