兔白细胞介素10基因克隆、多态性及表达的研究

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1、兔白细胞介素10基因克隆、多态性及表达的研究Genecloning，polymorphismsandexpressionofinterleukin10inrabbits研究生：万小颖导师：吴信生教授专业：动物遗传育种与繁殖国家兔产业技术体系专项(CARS．44．1)江苏省优势学科(2011—137)资助SupportedbytheModemAgriculturalIndustrialSystemSpecialFunding(CARS一44一1)，thePdodtyAcademicProgramDevelopment

2、ofJiangsuHigherEducationInstitutions(20l1-137)．万小颖：兔白细胞介素lO基因克隆、单核苷酸多态性及表达的研究兔白细胞介素10基因克隆、多态性及表达的研究嚣淼嶝-1螋一导师：吴信生教授二旦型二!!一专业：动物遗传育种与繁殖(扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州，225009)中文摘要细胞因子(cytokine)是一类由免疫细胞分泌后调节细胞功能的小分子多肽，它们在细胞的生长和分化等过程中发挥重要的作用。白细胞介素10(interleukinl0，IL．10)是其中一个典型

3、的代表，它是由多种细胞所分泌的因子，在调节免疫功能和炎症反应中起作用。目前国内外研究还主要集中于人IL．10基因启动子多态与疾病的关联性方面，对家兔IL．10基因外显子多态及该基因亚细胞定位等方面的研究鲜有报道。因此本研究以新西兰白兔为实验对象，对其IL．10基因编码区进行克隆和生物信息学分析；构建原核表达载体并进一步诱导蛋白表达以制备多克隆抗体，构建真核表达载体研究该基因在DF．1细胞中的定位；以新西兰白兔、福建黄兔为研究对象，利用PCR-SSCP法检测该基因5个外显子的多态性。试验主要研究内容及结果如下：1．I

4、L．10基因的克隆及生物信息学分析。利用RT-PCR技术从新西兰白兔脾脏总RNA中扩增出IL．10基因的CDS序列，并将其克隆至pMDl9．TSimple载体中。菌液PCR、酶切及测序结果均表明pMDl9．T-IL．10载体构建正确。分析兔IL．10基因，发现其cDNA全长为1,227bp，CDS编码区长537bp，共编码178个氨基酸残基，且第75至95位氨基酸之间存在1个功能位点。该蛋白分子质量约为20．15kDa，理论等电点pI为8．20，该蛋白是不稳定的脂溶性蛋白，在前21个氨基酸的位置存在信号肽，且不含有

5、跨膜结构，存在多个潜在的磷酸化位点。此外，该蛋白二级结构中只含有Gt螺旋和自由卷曲。同源性分析和进化树分析表明，家兔IL．10与哺乳动物亲缘关系较近，而与禽类和鱼类亲缘关系较2．IL．10基因外显子多态性及其与血清IL．10指标的关联性分析。PCR-SSCP结果表明，该基因第1、2、4和5外显子均不存在多态，外显子3中检测到3种基因型(AA，BB和AB)，1个SNP位点(A2150G)，且该突变为同义突变不造成编码的氨基酸的改变。血清中IL．10指标检测发现，新西兰白兔群体IL．10水平显著高于福建黄兔，且2个群体

6、中不同基因型个体间IL．10水平差异不显著。3．IL．10基因的原核表达及抗体制备。将克隆得到的IL．10基因亚克隆至原核表达载II扬州大学硕士学位论文体pET-32a，然后转化入表达菌株BL21(DE3)，利用IPTG成功诱导了IL一10基因的高效表达，SDS—PAGE电泳检测融合蛋白大小为37．7kDa，且主要以包涵体形式存在。将获得的融合蛋白纯化后作为抗原免疫2只健康豚鼠，并以此制备了多克隆抗体。ELISA检测抗体效价高达1：56，000，Westernblot检测抗体特异性强，为进一步探讨重组IL一10的生

7、物学功能及其在疫病中的作用奠定了基础。4．IL．10基因的真核表达及亚细胞定位。将克隆得到的IL．10基因亚克隆至真核表达载体pEGFP—C1，脂质体介导融合表达载体pEGFP．IL-10瞬时转染DF．1细胞，48h后在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光在细胞中的位置，发现融合蛋白分布在细胞质内；同时提取细胞总RNA与总蛋白，在mRNA及蛋白水平上均检测外源基因的表达，且融合蛋白大小69．6kDa，为深入研究IL．10基因的生物学功能奠定基础。关键词：IL．10基因；克隆；生物信息学；多态；重组表达万小颖：兔白细胞介素1

8、0基因克隆、单核苷酸多态性及表达的研究IIIGenecloning，polymorphismsandexpressionofinterleukin10inrabbitsM．S．Candidate：WanXiaoyingAdvisor：Prof．WuXinshengMajor：AnimalGeneticsandBreeding(CollegeofAnimalS