人白细胞介素10基因的克隆和表达

《人白细胞介素10基因的克隆和表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、徐州医学院硕士学位论文人白细胞介素-10基因的克隆和表达姓名：刘俊杰申请学位级别：硕士专业：外科学（泌尿外）指导教师：陈家存;孙晓青20030401橡螂医学院2003属鞭士研究生学位论文人自细胞介素一lO熬因的克隆和表达中文摘要目的：竟隆人扎-10eDNA熟垒长序列，稳建原核表这簸体并诱导其裘达。同时构建粪棱表达载体，为萁生耪擎进～步裁焉獒定基疆。方法：无菌条件下静脉粟取正常人外周m10rnl。加入等体积的生理盐水稀释后，加入淋巴细胞分离液，离心收集细胞，用10mlRPM【．1640培养液悬浮，加入10％小拳斑瀵、25蚌职避豹ConA鑫0，5％鳕双挠(渗蠖)，373C／5弼C02

2、蛰养羧孛褥弯。收集细胞，提取躺腿总RNA。埔特异性上游萼

3、物5’．CTTGCAAAAGCTTGCATGCACAG一3’(15～38bp)和下游引物5’．GAGGTAATAAGA棚盯CTATAAGAGAGGTAC一3’(674～703堙)，以缨胞总RNA为模扳，进行RT-PCR，克隆出iL．10cDNA，逶行酶韬签定及秘妊孝臻溅爱。焉表达零

4、物一上游雩

5、耪斡TGGGGTGACCAT疆3GCCCAGGCC，3’(72～94bp)和下游引物5’*GGTACAATAAGCT1TCTCAAGG．3’(657～678bp)，再次亚克隆IL-10cDNA并插入表达载体pMonqa，用pMon-

6、ILl0熏缀薅转染大翳耱莹DH5a。耀萘啶鬃酸诱孥使重组久IL-10在太强抒藏中表达，对袭达产物进行SDS．PAGE电泳。发现有与预期分子量一壤盼条带后，转移至硝酸纾缳索膜上，用巍抗人Ⅱ，10抗体和鼠抗兔I鳓进行一、二抗反应及DAB驻色，观察袭j纛产物的免疫艨性。结莱：夭秘周盘葶棱缩藤缝ConAN激嚣，l毛一l蚤转交瘩平缮瑟，获缨戆总RNA容易反转录扩增出11-10eDNA；PCR产物的分子量与预期分子量一致，插／Xq，cDNA3载体小制备后用酶切鉴定克隧片断正确；胤隆cⅨ妊经序列测定证实岛基因库发表瓣入也．10序裂巍全一蒙：垂缀黥也一lO覆羧转纯太弱杼蕊矮，经萘啶骥酸诱导褥到离

7、教表达，表运的蛋白质经SDS-PAGE电激发现在分子爨避18Kd壶一特异性条带，图象处理仪扫描分析表达爨占细菌总蛋白的20％左右；Western--blot分析表明表达的蛋白质能与兔抗人Ⅱ，10抗体特异性结合，证实表达的嫩自质是人的批。10蛋白。结论：入多}瘸斑葶菝纲藏绞Co矗A刺激葳，IL-10转录窳擎灌麴，鸯弱子IL-10cDNA的克隆；克隆的Ib-10eDNA缀测序证实与錾因库报告的序列完全一致，插入pMon栽体后经萘啶酮酸诱导能够猩大肠杆菌DH5磙达：表选的蛋白质能与兔抗人IL一10黪劳蛙结台；人IL-10eDNA坡成功壳建势懿够在太弱杼黧中表达。荚键词人白细胞介素。lO

8、基因克隆真核表达载体腻核表达徐州医学院2003届硕士研究生学位论文ClongingofhumanIL-10cDNAanditsexpressioninE．coilAbstractObjective：ToclonethefulllongthsequenceofⅡ一·10cDNAandeonstmcfingprimeexpressionvector，IL一10expressedinE．coli．bytheinductionofnalidixieacid．Alsotoconstructeukaryotieexpressionvectorforthepotentialutilizatio

9、nofIL-10inorgantransplantationandmakethebasisforfurtherexperiment．Methods：ThePBMrc嘴collectedtillderconditionsofsterilizationandincubatedinRPMll640medium而th10％FCSffetalcalfserum)underthestimulationofConAr25H∥rrd)．TotalcellRNAWasisolatedfromPBMCwiththeRNAgentsTotalIsolationSystem．Usingtotalcell

10、ularRNA船thetemplate,thecDINAofIL-IOWasamplifiedbyRT-PCR谢nlthes脚cificprimer,Sgl∞e5’一口广rGCAAAAGeTTGCATGCACAG-3。(15～38bp)andantisense5'-GAGGTAATAAGAATTCTATAAGAGAGGTAC．3’(674～703bp)．The／L-10eDNAWaSinsertedintopcDNA3vectorandWasidentifiedbyendonue