灰葡萄孢bcadr1基因调控病菌生长发育和致病力的功能研究

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1、万方数据分类号：密级：$436．412．1单位代码：学号：100862011078灰葡萄孢BcADRl基因调控病菌生长发育和致病力的功能研究FunctionanalysisofBcADRlingrowth，developmentandpathogenicityofBotrytiscinerea学位申请人：指导教师：，．毒学科专业：学位类别：授予单位：答辩日期：赵福鑫邢继红教授董金皋教授生物化学与分子生物学理学硕士河北农业大学二零一四年五月三十一日万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加

2、以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑兰垦盔些苤堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：掀签字日期：伊，中年占月夕日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑兰垦盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑皇垦壅些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学

3、位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：导师签名：却彬≯答_-T-日期：汐y哔年6月≥日签字日期：沙，V年占月3日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：万方数据摘要实验室利用农杆菌介导遗传转化(Agrobaeteriumtumefaciens．mediatedtransformation：ATMT)技术，构建了灰葡萄孢的T-DNA插入突变体库。通过筛选该ATMT突变体库，获得了一株不产生菌核的突变体BCt41，利用TAIL—PCR、PCR、Southemblotting、RT-PCR等技术，确定了其突变基因为编码一个功能未知的假定蛋白B

4、cADRl。为进一步明确BcADRl基因在灰葡萄孢生长发育和致病过程中的功能及其调控机制，本研究利用RT-PCR和Real．timePCR技术，对BcADRl基因的表达规律进行分析；利用基因互补回复技术，构建了BcADRl基因的互补回复突变体BCt41／BcADRl；通过对野生型BC22、突变体BCt41和回复突变体BCt41佃叫伽珀勺表型和致病力分析，确定了BcADRl基因对病菌生长发育和致病力的调控功能。通过对野生型BC22、T-DNA插入突变体BCt41和回复突变体BCt41倦删珀勺胞壁降解酶活性、毒素活性、产酸能力、穿透能力和附着胞形成、致病相关基因的

5、表达、响应逆境胁迫的能力等进行分析，探讨BcADRl基因调控病菌生长、发育及致病力的机制。为阐明灰葡萄孢的生长、发育和致病力的调控机制奠定基础。1．利用RT-PCR和Real．timePCR技术，检测野生型BC22的菌丝、分生孢子和菌核中BcADRl基因的表达水平。结果发现，BcADRl基因在病菌菌丝中的表达水平较高，而在分生孢子和菌核中未检测到该基因的表达。2．构建了BcADRl基因的互补回复载体pBARKSl-BcADRl．钮P，利用PEG介导的遗传转化技术转化T-DNA插入突变体BCt41的原生质体，利用草胺膦筛选转化子，通过PCR、Southernbl

6、otting和Real-TimePCR等技术对所获得转化子进行鉴定。确定了所获得的草胺膦抗性转化子为BcADRl的互补回复突变体BCt41／BcADRl。3．以灰葡萄孢野生型菌株(BC22)为对照，对T-DNA插入突变体BCt41和回复突变体(BCt41／艿洲排j)进行表型和致病力分析，发现BCt41的生长速率较野生型和回复突变体明显减慢，菌丝纤细、颜色浅，不产生菌核，产孢量明显增强，细胞壁较厚、且胞外分泌物；且BCt41的致病力明显减弱。表明BcADRl正调控灰葡萄孢的菌核产生、菌丝生长和致病力，负调控灰葡萄孢分生孢子的形成。4．与野生型BC22和回复突变体

7、(BCt41／BcADRl)相比，T-DNA插入突变体BCt41的果胶甲基反式消除酶(PMTE)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)、纤维素酶(Cx)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和乳糖醛酸酶(PG)的活性明显降低。突变体BCt41的毒素活性较野生型和回复突变体明显降低；产酸能力明显减弱。表明BcADRl突变影响灰葡萄孢胞壁降解酶活性、毒素活性、产酸能力。5．对野生型BC22、T-DNA插入突变体BCt4l和回复突变体(BCt41／BcADRI)的穿透能力和附着胞形成进行分析，发现3个菌株均能穿透玻璃纸，在PDA培养基上产生菌落；而突变体BCt41产生的附

8、着胞与野生型和回复突变体明显不同。表明