j亚群禽白血病病毒ah-j11株全基因组序列分析及其感染性克隆的构建

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1、AnhuiAgriculturalUniversityDissertationfortheMasterateSequenceanalysisandconstructionofinfectiouscloneofavianleucosisvirussubgroupJAH-J11strainCandidate:WangBeiSupervisor:WangGuijunCooperantSupervirsor:LiuGuangqingAcademicDegreeappliedfor:MasterofAgricultureSpeciality:PreventativeVeterinaryScience

2、Researchfield:InfectiousdiseasesofdomesticanimalCollege:AnimalScienceandTechnologycollegeJune,2013中文摘要禽白血病（AvianLeukosis，AL）是由C型禽反录病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。主要引起鸡的消瘦、生长发育不良和免疫抑制，此病在世界各国鸡群中广泛流行，是危害养鸡业的重要传染病之一。由于该病毒能够通过水平传播和垂直传播的两种方式扩散，现阶段主要通过淘汰携带病毒和患病鸡群，从而达到净化种群的目的。本研究根据GenBank上已发表的经典株HPRS-103株和SD07LK1株全基因

3、序列，设计并合成11对特异性引物，通过PCR方法将全基因组分为11个片段进行扩增，成功扩增出ALV-J安徽分离株AH-J11的全基因序列，并将其分别克隆至pMD18-T载体后进行序列测定、拼接，并与GenBank上发表的不同来源的国内外流行毒株进行核苷酸及其推导的氨基酸序列的同源性比较，分析遗传变异关系，绘制遗传进化树。序列分析比对结果表明，AH-J11株的全长为7844nt，由3个主要的结构基因gag、pol、env和两端的LTR组成；gag与pol基因为相对保守区域，而env基因为病毒的主要变异区，并且与HPRS-103株的全基因序列同源性最高，达到97.4%，遗传亲缘关系最近。研究结

4、果补充和丰富了ALV-J的基因组信息数据，为了解ALV-J遗传变异关系及构建全基因感染性克隆奠定了基础。其次，采用融合PCR方法将全长11段序列融合至4段J亚群白血病病毒AH-J11株的前病毒cDNA，PCR产物经克隆后顺次连接至pBluescriptIISK+载体上，构建该分离株的感染性克隆（pBlALV-AH-J11），将pBlALV-AH-J11重组质粒纯化后转染鸡胚成纤维细胞（CEF），拯救病毒，然后对拯救病毒（rALV-J）进行增殖培养，连续传代3次。分别利用RT-PCR、Western-blot和IFA方法，对拯救病毒进行鉴定。结果证明，本研究构建了AH-J11株的全基因组感染

5、性克隆，并拯救出了具有感染性的病毒，为研究J亚群禽白血病病毒的致病机理和探讨新的防制措施等提供了良好的ALV的反向遗传操作技术平台。最后，为构建以J亚型禽白血病病毒（ALV-J）的LTR元件为启动子的真核表达载体，将ALV-JLTR克隆至pBluescriptIISK(+)载体中，并在5’LTR和3’LTR之间分别插入报告基因（eGFP）和新城疫病毒（NDV）的NP基因，得到重组质粒pSK-LTR-GFP和pSK-LTR-NP。将上述重组质粒分别转染293T细胞、BHK-21细胞和鸡胚成纤维细胞（CEF），应用RT-PCR、westernblot和荧光显微镜检测目的基因的表达。结果表明，无

6、论是在哺乳动物细胞（BHK-21和293T）还是在禽原代细胞中，LTR均能启动外源基因（eGFP和NP）良好转录和表达。流式细胞仪（FCM）分析结果显示，报告基因在293T细胞中的表达在48h达到高峰。本研究为利用ALV-JLTRI元件构建输送或表达外源基因的质粒载体奠定了基础。关键词：ALV-J，全基因组，感染性克隆，LTR启动子IIAbstractAvianLeukosisisageneraldesignationofavarietyofavianneoplasticdiseasescausedbyAvianLeukosisVirus,whichwidespreadbyvertical

7、andhorizontaltransmissioninchickenflocksaroundtheworld.AvianLeukosiscancausefleshless,maldevelopment,immunodepressionanddeath.Becauseviruscanbetransmittedthroughhorizaontalandverticaltransmission,currently,somepo