l-羟脯氨酸单克隆抗体的制备及应用

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1、分类号：S墨5窆：墨垒密级：公珏单位代码：!QQ墨互学号：2Q!鳢鱼L一羟脯氨酸单克隆抗体的制备及应用PreparationandApplicationoftheMonoclonalAntibodyforL．hydroxyproline，-，-学位申请人：王丽莉指导教师：刘聚祥教授合作指导教师：王建平副教授学科专业：基础兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一三年五月二十九日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文

2、中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑兰堡盔些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：刁门辑勾签字日期：剜弓年j月≥1日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑皇垦壅些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑兰垦盎些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文

3、。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：硐勾签字日期：ⅥR年y月≥1日’学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：翩橼农侈砰签字日期：’冽≥年j月3／日电话：邮编：本研究由河北省科技支撑计划项目(编号U221001D)资助摘要中国政府已经禁止将皮革固体废弃物制成的动物水解蛋白添加至牛奶中。因此，必须要对牛奶中可能非法添加的“皮革水解物"进行监控和检测。L-羟脯氨酸(HP)是动物水解蛋白中特有的氨基酸，通过检测牛奶中的L．羟脯氨酸可以判定牛奶中是否添加了动物水解蛋白。为探索一种能快速有效检测牛奶中L一羟脯氨酸的

4、方法，本研究将L-羟脯氨酸分别用对羟基苯甲醛、乙酰氨基苯磺酰氯和5．氯戊酸进行衍生化，合成了三种半抗原HPH、HPl和HP2。并采用N'N’．羰基二咪唑法将HPH分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)连接制备免疫抗原和包被抗原；采用戊二醛法合成了HPl对应的免疫抗原和包被抗原；采用混合酸酐法合成了HP2对应的免疫抗原和包被抗原。N’N’．羰基二咪唑法合成的免疫原的偶联比为14：1，包被原偶联比为12：1：戊二醛法合成的免疫原的偶联比为22：1，包被原偶联比为15：1；混合酸酐法合成的免疫原的偶联比为13：1，包被原偶联

5、比为9：1。以三种免疫原分别免疫Balb／c小鼠，利用间接ELISA方法评价不同的包被抗原与抗体组合，经过多次试验，表明免疫原HPH．BSA具有较好的免疫特性。选择血清效价最高且对半抗原有明显特异性的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞。运用间接竞争ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株，采用有限稀释法经过多次筛选得到三株阳性杂交瘤细胞株。将其注入小鼠腹腔制各腹水，通过辛酸．饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水，得到针对半抗原HPH的单克隆抗体。该单克隆抗体对原形L．羟脯氨酸的交叉反应性很低，对D．羟脯氨酸和其他氨基酸无交叉反应性。将牛奶样品

6、用浓硫酸高温加热水解，释放出游离的L-羟脯氨酸，再用对羟基苯甲醛进行衍生化，然后进行ELISA检测。该ELISA方法对HPH的最低检测限为O．08l上g／mL，相当于对HP的最低检测限为0．04gg／mL。L．羟脯氨酸在空白牛奶中的添加回收率为88．6％～102．5％，变异系数为4．1％'--9．7％。因此，该ELISA法可用于牛奶中L一羟脯氨酸的快速检测，以监控牛奶中是否非法添加了动物皮革蛋白水解物。关键词：L．羟脯氨酸，半抗原，ELISA，单克隆抗体，牛奶Preparationandappficationofthemonoc

7、lonalantibodyforL-hydroxyprolineCandidate：WangLiliMajor：BasicVeterinaryMedicmeAdvisors：LiuJuxiangWangJianpingAbstractChinagovernmenthasprohibitedtheadditionofsimplyhydrolyzedanimalproteinfromsolidleatherwasteintomilk．Therefore，itisveryimportanttomonitorthepossiblyadd

8、edsolidleatherwasteinmilk．L-hydroxyproline(HP)isaspecialaminoacidinhydrolyzedanimalprotein．IfHPiSdetectedinamilksample，thesamplecan