登革病毒复制子载体的构建及其功能鉴定

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1、北京化工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：丛垦亟关于论文使用授权的说明学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容

2、，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。口论文暂不公开(或保密)注释：本学位论文属于暂不公开(或保密)范围，在一年解密后适用本授权书。口非暂不公开(或保密)论文注释：本学位论文不属于暂不公开(或保密)范围，适用本授权书。作者签名：邀＆竭导师签名：镒日期：垫f终≤：墨日期：2旦!堡』：鱼学位论文数据集中图分类号Q52学科分类号180．642论文编号1001020141149密级学位授予单位代码lOOlO学位授予单位名称北京化工大学作者姓名张风娟学号2011201149获学位专业名称化学工程与技术获学位专业代码0817课题来源国家自然科学基金研究方向分子病毒学论文题目

3、登革病毒复制子载体的构建及其功能鉴定关键词登革病毒；复制子载体；报告基因论文答辩日期2014．05．25术论文类型基础研究学位论文评阅及答辩委员会情况姓名职称工作单位学科专长指导教师张鹏副教授北京化：f大学微生物学评阅人l李灏副教授北京化工入学微生物学评阅人2鲁茁壮研究员中国疾控中心分子病毒学评阅人3评阅人4评阅人5答懒会主席冯嵬教授北京化jI：人学生物‘1。：程答辩委员1王芳教授北京化j[大学生物化：【：答辩委员2张栩教授北京化：1j大学生物化二[答辩委员3邓利副教授北京化：I：火学生物化工答辩委员4秦培勇副教授北京化_I：人学生物]：程答辩委员5注：一．论文类型：1．基础研究2

4、．应用研究3．开发研究4．其它二．中图分类号在《中国图j}_；5资料分类法》查询。三．学科分类号在中华人民共和国国家标准(GB／T13745—9)《学科分类与代码》中查询。四．论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。摘要登革病毒复制子载体的构建及其功能鉴定登革病毒(denguevirus，DENV)隶属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)病毒，是一类经蚊媒传播的、有包膜的RNA病毒。我国境内几乎每年都有数百例感染登革病毒的病例报告，该病毒可使人和动物患病，其感染特点是患病率高但治愈率却比较低，人感染后易给入带来一些严重的后遗症，严重威胁人类健康

5、。且登革类疾病临床上也缺乏有效的抗病毒药物，因此该类病毒感染的早期诊断及新型疫苗研发对有效控制登革类黄病毒疫隋的传播尤为重要。已有研究结果表明，以登革等黄病毒基因组RNA为基础的复制子载体技术己广泛用于新型疫苗研发、抗病毒药物筛选等应用研究领域，在病毒复制和翻译的调控分子机制等基础研究也得到了广泛的应用。登革病毒的基因组长约11kb，属于包膜的单股正链RNA病毒，由57和37非编码(untranslatedregion，UTR)及中间单一的开放读码框组成(openreadingframe，ORF)，其中开放读码框编码三个结构蛋白(C、prM／M、E)和七个非结构蛋白(NSl、NS2

6、A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NSS)。结构蛋白主要参与病毒的组装过程，非结构蛋白及57和37UTR在病毒RNA的复制和翻译的起始及调控起重要作用。RNA复制子基于相应病毒全长感染性克隆技术，将病毒复制和翻译必不可少的重要顺式作用元件(包括57和37UTR、全部病毒非结构蛋白基因和部分必要的病毒结构蛋白基因)保留，其缺失了大部分结构蛋白基因或由外源基因替代构构建的病毒复制子。本研究在登革病毒4型感染性cDNA克隆p4上删除病毒大部分结构基因prM-E，构建了登革病毒复制子载体p4一AprME。为验证复制子载体的包装功能，将红色蛋白报告基因mCherry克隆至复制子载体p

7、4．AprME构建工程载体p4．AprME—mCherry，同时构建缺失RNA依赖RNA聚合酶(RDRP)核心序列GDD的缺陷型复制子载体p4．△prME-mCherry．AGDD。体外转录和细胞转染实验结果显示，源自p4．△prME-mCherry的转录体RNA转染Vero细胞后可持续呈现特异性的红色荧光，且在转染后24h～96h可形成稳定的信号峰。与之相比，缺失RDRP核心序列GDD的缺陷型复制子载体在转染细胞后无特异红色荧光出现。以上研究结果表明，我们所构建复制