pegfpbmi1真核表达载体的构建、鉴定及其表达

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1、pEGFPBMI1真核表达载体的构建、鉴定及其表达：陈凤花，胡丽华，王琳，李一荣【摘要】本研究构建真核表达载体pEGFPBMI1并观察其在HeLa细胞中的表达。将BMI1逆转录聚合酶链反应(RTPCR)产物克隆入pEGFPN1，经酶切、PCR鉴定及测序分析，构建pEGFPBMI1真核表达载体；采用脂质体转染法，将融合基因pEGFPBMI1转入HeLa细胞，用荧光显微镜和I1的全长编码基因，序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pEGFPBMI1的HeLa细胞中存在荧光分布；I1EGF

2、P的表达。在HeLa细胞中过表达BMI1显著下调P16INK4amRNA的表达为对照组的9.2％(P<0.01)。结论：成功构建了真核表达质粒pEGFPBMI1，转染HeLa细胞后可表达融合蛋白BMI1EGFP。这为今后研究BMI1在肿瘤发生发展中的机制奠定了基础。【关键词】基因转染Construction,IdentificationandExpressionofRebinantEukaryoticVectorpEGFPBMI1AbstractThisstudyammalianexpressionvector

3、ofpEGFPBMI1andtodetectancervixcancercelllineHeLa.ThecDNAfragmentofBMI1obtainedbyRTPCRidedbyrestrictionenzymedigestion,PCRandDNAsequencing.pEGFPBMI1ine2000.TheexpressionofpEGFPBMI1inedbyEGFPfluorescenceandI1hasbeenshoedigestion,PCRandDNAsequencing.pEGFPBMI1co

4、uldexpressBMI1EGFPfusionproteininHeLacells.RealtimeRTPCRshoRNAexpressionatol2007;15(5):1056-1060PcG(polybgroup，PcG)基因家族以多蛋白复合体的形式调控靶基因的表达［1］，无论在果蝇还是哺乳动物的定向发育以及细胞的增殖、分化、凋亡等生命现象中都起着决定性的作用。在人类，PcG至少存在着两种不同的复合体，一种为PRC1，包括BMI1、RING1、HPH1、HPH2、HPC1、HPC2、HPC3和CtBP；另一种为PR

5、C2，包括EED、EZH2、SUZ12、YY1和HDAC1/2。BMI1(Bcellspecificmoloneyleukemiavirusinsertionsite1，BMI1)是PcG家族PRC1复合体中的重要成员，为过表达cmyc转基因小鼠中鉴定的原癌基因［2］，与果蝇PcG基因高度同源，在DNA损伤修复、细胞周期调控、染色质的稳定、基因转录激活以及细胞凋亡等方面起着重要作用。选择性敲除BMI1的小鼠可导致出生后进行性发育迟缓、神经系统的异常和严重的造血缺陷。本研究旨在构建和鉴定真核表达质粒pEGFPBMI1并瞬

6、时转染人宫颈癌细胞系HeLa，观察其表达以及其对P16INK4amRNA表达的影响，为进一步探讨BMI1基因的生物学作用及其机制奠定基础。材料和方法细胞培养真核表达载体的构建、鉴定及其表达人类乳腺癌细胞系MCF7和宫颈癌细胞系HeLa按常规培养，培养液为含10%新生牛血清的RPMI1640，在37℃、5%CO2的孵箱中进行培养。试剂和仪器载体pEGFPN1、细胞系MCF7和HeLa以及大肠杆菌E.coliDH5α由本室保存。RPMI1640培养液和新生牛血清购自Gibco公司。TRIZOL、Lipofectamine2000和O

7、ptiMEM为Invitrogen公司产品。逆转录试剂、T4DNA连接酶购自Promega公司。引物由上海博亚公司合成。各种限制性内切酶和Pyrobest高保真酶、DNAMarkerDL2000和λEcoT14IdigestDNAMarker购自大连宝生物公司。胶回收试剂盒和质粒小量抽提纯化试剂盒购自上海华舜公司。βactin和BMI1抗体分别购自美国SantaCruz和Upstate公司。HRP标记的山羊抗小鼠IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG、CF7细胞离心沉淀后溶于1mlTRIZOL后，接着按TRIZOL说明书进行操作

8、。最后DEPC处理的蒸馏水溶解RNA，60℃孵育10分钟，立即冰浴5分钟，破坏RNA的二级结构，电泳检测RNA是否降解。cDNA合成反应体系：①5×缓冲液：5μl；②dNTP(10mmolL)：2.0μl；③Oligo(dT)15pr