yy1基因对水牛植入前胚胎dna甲基化影响的初步研究

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1、分类号——UDC密级硕士学位论文YYl基因对水牛植入前胚胎DNA甲基化影响的初步研究龚云论文答辩日期2Q13生鱼旦三旦学位授予日期答辩委员会主席庄壶逸数援J煳黜广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的

2、部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。，孵保密。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：拓．指导教师签名：，参谢者，作者联系电话：14795724j528日期：刎多．多．岁日期如限，厂电子邮箱：283148675@qq．comYYl基因对水牛植入前胚胎DNA甲基化影响的初步研究摘要阴阳因子1(YYl)是一种广泛存在于生物体中并在进化上高度保守的转录因子，它可以作为基

3、因表达过程中的激活因子和抑制因子参与许多基因的转录调控。为了解YYl基因在水牛植入前胚胎中的表达规律及其对DNA甲基化的影响和调控作用，本研究克隆了水牛YYl基因编码序列，构建了其真核表达载体；筛选抑制水牛YYl基因表达的shRNA干扰片段，同时探讨了YYl基因过表达对水牛胚胎早期发育及DNA甲基化的影响。1．水牛YYl基因CDS全长序列克隆及其真核表达载体构建。以水牛成纤维细胞eDNA为模板，采用RT-PCR和降落PCR的方法，扩增水牛YYl基因CDS全长序列。将目的片段连接到pEGFP-N1载体中构建真核表达载体，然后转染293T细胞和水牛成纤维细胞(BFF)，通过荧光观察和qRT

4、-PCR方法检测YYl基因表达情况。结果显示，克隆得到的水牛YYl基因CDS全长序列为1248bp，与牛、人、小鼠、大鼠及鸡的同源性达到90％以上。重组质粒pYYl．EGFP-N1可在293T细胞和水牛成纤维细胞中表达；在水牛体细胞水平上，YYl基因表达可促进DNMTl基因的表达。2．水牛YYl基因表达shRNA干扰片段的筛选。以黄牛YYl基因编码区序列为模板，设计并合成2条shRNA片段，构建其慢病毒表达载体pSicoR-GFP-YYlshRNAl／2。将构建的过表达水牛YYl基因真核表达载体与shRNA表达载体分别以1：1和1：6的比例进行共转染，以pSicoR-GFP和pSico

5、R-GFP-1864质粒作为空白和阴性对照。采用qRT-PCR和Western-blot方法检测shRNAs的抑制效率。结果发现，设计合成的2条shRNA序列对水牛YYl基因表达均有抑制效果；定量结果显示，pSicoR-GFP-YYlshRNA2I(93．64％)的抑制效果显著高于shRNAl(53．77％)。3．YYl基因过表达对水牛胚胎发育及DNA甲基化的影响。采用线性化处理的质粒，对体外受精8-10h后的水牛受精卵进行卵胞质注射。分析质粒注射浓度、不同外源DNA质粒对水牛胚胎发育及外源基因表达状况的影响；同时采用qRT-PCR方法分析YYl基因过表达对植入前胚胎发育及DNMTl基

6、因表达的影响。结果发现，受精卵胞质注射25pg／mLpYYl．EGFP-N1质粒对水牛囊胚发育率无显著影响(P>0．05)，并取得较高表达EGFP的囊胚比例(33．3％)，显著高于其他注射浓度(5，15，50肛g／mL)(尸<0．05)；注射不同质粒(pEGFP-N1、pYYl．EGFP-N1)对囊胚外源基因表达率影响不显著(P>0．05)，注射pYYl-EGFP-N1质粒组的囊胚发育率与未注射组相比差异不显著(P>0．05)；YYl和DNMTl．基因在水牛植入前胚胎的表达模式呈相反的趋势，随着胚胎的发育，YYl基因的表达逐渐增高，囊胚期达到最高，相反，DNMTl基因在桑葚胚前表达较高

7、，囊胚期表达最低；YYl基因过表达在胚胎水平上会增加DNMTl基因表达，提高水牛胚胎DNA甲基化水平。结论：克隆得到的水牛YYl基因CDS全长序列在生物进化上具有高度保守性；构建的pEGFP-N1一YYl重组质粒可以转染水牛体细胞，W1基因过表达在体细胞水平上会促进DNMTl基因的表达；筛选得到的2条shRNA干扰序列均能有效抑制水牛YYl基因的表达；水牛植入前胚胎YYl和DNMTl基因的表达模式呈相反的趋势，YYl基因过表达使水牛胚胎DNMT