stra8基因克隆表达及其功能的初步研究

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1、国家自然科学基金项目NaturalScienceFundofChina(No．31272429)江苏省高校自然科学重大基础研究项目(08KJA230001)江苏省“六大人才高峰"基金Stra8基因克隆表达及其功能的初步研究研究生：王丹导师：李碧春专业：动物遗传育种与繁殖(扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009)中文摘要胚胎干细胞(EmbryonicStemCells，ESCs)是具有高度未分化、自我更新及分化为包含生殖细胞在内的成体器官及组织的全能性细胞。研究和利用ESCs是当前生物工程领域的热点

2、及核心问题之一。鸡胚胎干细胞(chickenEmbryonicStemCells，cESCs)是从新鲜鸡X期胚盘明区分离获得的细胞，此时胚盘约有6万个细胞，它们可在体外特定的培养基中保持多能性和全能性，这为研究早期胚胎发育及分化提供了优良的模型。近年来，已有很多关于不同方法体外诱导ESCs分化为生殖细胞的报道，其中利用视黄酸(RetinoidAcid，RA)进行诱导较为常见，这可能是因为RA在胚胎干细胞诱导及细胞凋亡方面发挥重要作用，它能直接进入细胞核内，与其受体结合后作用于靶基因，从而调控胚胎发育及组

3、织形成。并且由RA激活的基因Stra8(StimulatedbyRetinoidacidGene8)的表达是生殖细胞进行减数分裂的关键。目前，有关该基因的研究主要集中在小鼠等模式生物以及人和一些哺乳动物方面，对于禽类该基因的研究较少，且有关该基因对于生殖细胞减数分裂的作用机制尚未阐明。本研究采用RT-PCR方法克隆出苏禽黄鸡睾丸组织中Stra8基因序列，生物信息学分析有关该基因亚细胞定位、蛋白二级结构等相关信息，构建真核表达载体pcDNA3．1(+)．Stra8、质粒纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体，采用增

4、强型荧光蛋白(enhancedfluorescentprotein，EGFP)及制备的多克隆抗体验证该基因亚细胞定位，用RA诱导转染pEGFP．C1．Stra8的鸡胚胎干细胞向生殖细胞分化，采用qRT-PCR及间接免疫荧光检测诱导过程中特定基因的表达变化情况。主要研究结果如下：克隆苏禽黄鸡Stra8基因的eDNA序列全长645bp，共编码214个氨基酸，其中碱性氨基酸12个、酸性氨基酸47个以及60个疏水性氨基酸和66个极性氨基酸。将序列提交至GenBank获得登录号：JX204292．1。经过预测该基

5、因定位于细胞质，蛋白大小为24．3kDa，等电点为4．2，其序列与原鸡Stra8的氨基酸序列同源性高达99％，和火鸡的为95％，与斑胸草雀的为76％，和一些灵长类、哺乳动物以及啮齿类动物同一性在40．55％之间，和其他物种的同源性较差，上述结果说明Stra8在禽类中保守性较好。构建pEGFP．C1一Stra8及pcDNA3．1(+)-Stra8真核表达载体，纯化质粒pcDNA3．1(+)．Stra8免疫小鼠制备Stra8抗体，效价检测结果为1：100。采用脂质体介导重组质粒pEGFP．C1．Stra8转

6、染NIH．3T3细胞及间接免疫荧光进行亚细胞定位。结果表明，Stra8蛋白定位于细胞质，与预测结果相符合。通过提取转染48后细胞总RNA及蛋白进行RT-PCR及WesternBlot检测重组质粒在NIH．3T3细胞中的整合情况。结果表明，外源Stra8基因在mRNA水平上发生转录，在蛋白水平上发生融合表达。上述结果为建立稳定表达的细胞系及研究禽类Stra8蛋白表达及其功能发挥奠定了基础。采用药勺法获取鸡X期胚盘，吹散胚盘以1×105／孔接种入24孔板内进行培养。摸索重组质粒pEGFP．C1．Stra8转

7、染cESCs的最适用量，并使用G418进行筛选，所得细胞经挑克隆及酶消化联合法传代培养。结果表明，使用1．2lag的质粒量可获得较高的转染效率。经G418筛选2w所得细胞再用1×10。5mol／L的RA进行诱导，并设置3组对照。qRT-PCR检测Sox2、Dazl、Stra8及integrina6在2d、4d、6d、8d、10d、12d的基因表达量变化情况。实验组中，在RA诱导下，Stra8基因表达量明显高于其它对照组，Dazl和integrina6表达量逐渐升高，但Sox2表达量渐次下降，诱导12d时

8、，间接免疫荧光检测到Dazl、Stra8及integrina6蛋白在实验组及对照组1中有表达。结果表明诱导剂RA可在体外成功诱导转染Stra8基因的cESCs高表达Stra8，从而使其向生殖细胞分化。关键词：鸡；Stra8基因；抗体制备；胚胎干细胞；生殖细胞；诱导分化川Studyongenecloning，expressionofStra8anditsfounctionM．S．Candidate：WangDanAdvisor：Prof．Li