尿嘧啶衍生物的合成及胸苷酸合成酶抑制剂活性测定方法的建立

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1、尿嘧啶衍生物的合成及胸苷酸合成酶抑制剂活性测定方法的建立学位论文完成日期：2013年5月20日指剥懈：舔：!型／斤。竺=答辩委员会成员签字：墨竖山戌1硷1耽虫≠青岛科技大学研究生学位论文尿嘧啶衍生物的合成及胸苷酸合成酶抑制剂活性测定方法的建立摘要胸苷酸合成酶(ThymidylateSynthase，TS)是一种叶酸依赖性酶，催化生物体内27．脱氧尿苷．5’．磷酸(dUMP)甲基化形成2’一脱氧胸苷一5’．磷酸(dTMP)，后者进一步代谢为脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，dTTP是DNA合成所必需的前体物质，因此TS在细胞增殖中起着非常重要的作用，抑制TS等同于抑制DNA的生

2、物合成，从而抑制肿瘤细胞的生长。近年来，胸苷酸合成酶成为肿瘤化学治疗的热门靶点之一，其抑制剂是抗肿瘤药物研究的一个重要方向。本文主要进行了以下方面的工作：1TS蛋白的高效表达及纯化：本部分利用实验室自制重组菌株TS．pET-28b(+)／Rosseta(DE3)表达TS蛋白，实验结果得变性条件下TS分子量大小为36．0kDa，目的蛋白在细胞总蛋白中含量占42．1％左右，TS最佳表达条件是：温度37。C，IPTG浓度为1．5mM，诱导时间为8h；重组蛋白中含有6×His-tag标记，用Ni-NTA亲和层析进行纯化，最终得到纯度为90％以上的重组TS蛋白。2胸苷酸合成酶辅因

3、子mTHF的合成：实验中通过正交试验优化反应条件，对反应条件进行探索。从四氢叶酸纯度的角度分析四氢叶酸合成的最佳反应条件为：温度60℃、反应时间1．5h、N82S204加入量为1．59，四氢叶酸纯度达到66．1％。3胸苷酸合成酶抑制剂重要中间体的合成：化合物A由尿嘧啶衍生物和喹唑啉环两部分组成。所设计化合物结构新颖无文献记载，查阅了大量的相关文献，总结经验设计如下合成路线。实验两部分分别以尿嘧啶和间甲基苯胺为原料，经羟醛缩合、肟化、水解、氧化、闭环以及自由基溴化等反应，合成了抑制剂A。各步中间体均测定熔点，经过1瑚沁很等方法得到确证。4TS蛋白复性及抑制剂活性测定：以提

4、取纯化的人TS为原料，利用氧化一还原转化透析系统进行复性，通过紫外分光光度法测定酶活力，复性后hTS的酶活力为0．0137U，比活力为0．11U／mg。通过测定已知抑制剂培美曲塞(LY231514)和雷替曲塞(Tomudex)IC50值分别为：6．5xlO-6M、7．4×10。5M，中间体6—9的IC翮值分别为：3．45×lO。2M、4．62×10-4M、7．84×10‘5M、4．62×lO’5M。关键词：胸苷酸合成酶抑制剂重组蛋白生物活性中间体尿嘧啶衍生物的合成及胸苷酸合成酶抑制剂活性测定方法的建立II青岛科技大学研究生学位论文SYNTHESISOFURACILDER

5、IV灯IVESANDESTABLISHTHEDETERM【NATIONⅣ匝THODOFTHY姐DYLATESYNTHASEINHIBITORSACTIVITYABSTRACTThymidylatesynthase(TS)asafolate—dependentenzyme，catalyzesthereductivemethylatonofdUMPbyCH2H4folatetoproducedTMP,whichissubsequentlymetabolisedtothymidinetriphosphate(dnm)，exclusivelyforincorporationin

6、toDNAduringsynthesisandrepair．TSplaysaveryimportantroleincellproliferation．ThettlmorcellproliferationandgrowthweresuppressedbyrestainingtheactivityofTS．Inrecentyears，TSbecomesahottargetincancerchemotherapy．InhibitorofTSisanimportantdirectionofanticancerresearch．Consequently,achievementso

7、fthisresearchareasfollows：lExpressionandpurificationofTSprotein：ThelaboratoryrecombinantstrainsTS—pET-28b(+)／Rosseta(DE3)wasusedtoexpressTSprotein，TSmolecularweightwas36．0kDa,theyieldWasabout42．1％oftotalp晖oteincontent．bestexpressionconditionwere"37℃，8h，IPTGconcentrationof