山羊骨骼肌表达载体pimau-egfp的构建

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1、分类号S813.3学校代码10129UDC636学号2010201009山羊骨骼肌表达载体pIMAU-EGFP的构建ConstructionoftheExpressionVectorpIMAU-EGFPofGoatSkeletalMuscle申请人：杨波学科门类：农学学科专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：绒山羊遗传育种指导教师：李金泉教授张文广教授论文提交日期：二○一三年六月摘要目前尚缺乏研究山羊肉品质基因的适宜模型，有关山羊肉分子机理的研究还相对落后。鉴于转基因技术存在一系列潜在危险且改变基因组难度

2、较大，本论文借鉴人类基因治疗的理念和原理构建了适合携带外源基因的山羊骨骼肌特异表达载体。我们利用骨骼肌α-肌动蛋白的调控原件，肌肉钙粘蛋白M-cadherin的信号肽以及EGFP基因共同构建了可以直接在动物体肌肉细胞内异位表达并分泌EGFP的表达质粒pGEM-A5A3f-M-EGFP（pIMAU-EGFP）。该载体的构建为研究山羊肉肉品质基因奠定了重要的基础。本研究得出的结论如下：1、成功获得本研究中的转录起始单元：骨骼肌α-肌动蛋白启动子5’-侧翼区核苷酸序列，大小为2440bp以及大小为816bp

3、的携带Ploy(A)尾的骨骼肌α-肌动蛋白启动子3-’侧翼区核苷酸序列。通过测序验证，表明构建的表达载体中这部分元件是正确可靠的，可以行使转录驱动功能。2、根据Genbank登录号为：NM_007662的参考序列，人工合成含有63bp的M-cadherin基因序列，限制性酶切位点，以及与EGFP基因有20bp重叠区的大引物M-m-cadherin，利用重叠延伸PCR技术成功获得了本载体的核心基因M-EGFP。3、本研究成功构建了大小为6967bp，以M-EGFP为核心基因的骨骼肌特异表达载体pIMAU

4、-EGFP，经测序验证其序列的正确性。M-cadherin基因和EGFP基因之间设计的双酶切位点用于后续与肉品质相关的候选基因的插入，为山羊肉质特征功能研究奠定基础。关键词：骨骼肌；M-钙粘蛋白；EGFP；组织特异性表达载体ConstructionoftheexpressionvectorpIMAU-EGFPofgoatskeletalmuscleAbstractThereisalackofsuitablemodelofgoatmeatqualitygenes,studiesofgoatmolecul

5、armechanismarerelativelybackward.Inviewofgeneticallymodifiedtechnology,aseriesofproblemsaboutpotentialchangegenomeisdifficultanddangerous.Inthispaper,basedontheprincipleofgenetherapy,thegoatskeletalmusclespecificexpressionvectorwasconstructed.Regulatory

6、elementsofalpha-actinsforskeletalmuscle,M-cadherinandthereportgene(EGFP)weregottentogethertoconstructthevector(pGEM-A5A3f-M-EGFP)thatcandirectlyexpressandsecreteinthemusclecellsofanimals,whichlaidafoundationforimprovinggenefunctionandgeneexpression.Ther

7、esultsareasfollows:1.Transcriptioninitiationunitinthesuccessofthisstudy:skeletalmusclealpha-actinsproteinpromoter5'-flankingregionnucleotidesequenceand3'-flankingregionnucleotidesequence,theirsizesare2440bpand816bp,respectively.Bysequencingofvalidation,

8、itshowsthatintheconstructionofexpressionvectorofthispartoftheelementisaccurateandreliable,andcanexercisethetranscriptiondrivefunction.2.BasedonGenbankaccessionnumber:NM_007662referencesequencesynthesized63bpM-cadherinsequence,res