玫瑰孢链霉菌代谢通量的分析及戊糖磷酸途径改造论文

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1、天津大学博士学位论文玫瑰孢链霉菌代谢通量分析及戊糖磷酸途径改造姓名：王国英申请学位级别：博士专业：化学工程与技术；生物化工指导教师：闻建平201012摘要达托霉素是一种新型脂肽类抗生素，由玫瑰孢链霉菌发酵生成，具有在体外抗绝大多数临床革兰氏阳性菌的作用。2009年Cubicill(达托霉素商品名)的销售额达到5．38亿美元，并有望在未来几年达到10亿美元。因此对达托霉素进行深入研究和开发具有重要意义。目前，国内外尚无玫瑰孢链霉菌代谢通量分析和指导基因工程改造的报道。本文拟通过构建玫瑰孢链霉菌代谢网络，进行代谢通量分析预测目标基因，采用基因工程手段改造菌种并进行发酵验证

2、，获得具有我国自主知识产权的高产达托霉素基因工程菌株。首先将天蓝色链霉菌代谢网络收录的开放式阅读框与玫瑰孢链霉菌NRRI，11379基因组序列进行比对，建立了初始反应列表；通过补充达托霉素合成反应、细胞合成反应、运输反应以及添补网络空缺，建立了玫瑰孢链霉菌的代谢网络。由结构分析识别了网络中的关键节点和关键代谢途径。基于构建的代谢网络，对玫瑰孢链霉菌进行了代谢通量分析，研究了不同稀释率对碳代谢流进入戊糖磷酸途径、糖酵解途径和三羧酸循环通量的影响，并分析了丙酮酸和a．酮戊二酸节点的通量分布。通过模拟比达托霉素生成速率增加后的通量分布，发现主代谢网络中流经戊糖磷酸途径的变化

3、最大，因此预测基因工程改造的目标基因：扩增戊糖磷酸途径中产NADPH酶的编码基因。克隆得到玫瑰孢链霉菌的6．磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因删，3，由TA克隆构建重组载体pTA2啊仍，并构建了表达载体pIBl39哪怕，通过接合转移、抗生素选择性培养，得到了烈归高表达的玫瑰孢链霉菌菌株，在含有葡萄糖和无机氮源的基础发酵培养基上培养，达托霉素产量由365．5mg／L提高到411．6mg／L，增长了12．6％。证明代谢通量分析对目标基因的预测是正确的，通过代谢通量分析能够成功的指导基因工程改造，进而提高目标产物的产量。将基因工程菌在7．5L发酵罐中发酵，通过双阶段溶氧转换方法，达

4、托霉素产量达到758．2mg／L，比最优的常数控制(300rpm)下的产量655．8mg／L提高了15．6％。建立了以达托霉素为产物的动力学模型，该模型能较好的反映分批发酵过程。关键词：代谢网络，代谢通量分析，基因工程，达托霉素，玫瑰孢链霉菌ABSTRACTDaptomycinisanoVellipopeptide锄tibioticwhichw嬲producedby脚幻叼彬Ps加船D印D，．淞‘andc锄resistt0mostgram-positiVebacteria．Cubicin，thecommercialn锄eofdaptomycin，hadasalesof5

5、38milliondolla体inyear2009．TheappHcationofmetabolicflux锄alysisof勋印幻叼旧鲫m卵D印Dr淞togeneticengineeringhadnotbeenreported．Inthisworl【，themetabolicnetworkof泐幻彬)，a络加卵D妒D，．螂wascon蛐mcted．As仃ategyw嬲deVelopedbasedonmetabolicflux锄alysis锄dageneticengineeringstrainwascons仃uctedwitllmolecularbiologytech

6、nology．Thenthee仃．ectondaptomycinproductionwaSalsoinVestigated．Andthegeneticengineering舳inofChineseintellectualpropertyri曲ts、)l，asobtained．AninitialreactionliStwasbuiltbyblastingtlleopenreading仔锄ecoIle曲甜inthem以bolicnet、)l，orkof勋印幻叼嬲∞P眈D肠，．A3(2)againstthegenomesequenceof&，印幻刀纱卯sm船D印D，．淞NR

7、RLll379．Wimaddingdaptomycinsynthesisrcaction，biomassSynthesisreaction，仃ansportreaction锄dgapfilling，themetaboIicne铆orkof脚幻刀zy卯J加韶。戈印，．淞wasconsn．IIcted．Andthemainnodes锄dmetabolicpathwayswererecogn泣edbytopological柚alysis．Based0ntheme讪olicne觚。止metabolicfluX粕alysisw嬲conducted．Theefr