白假丝酵母菌生物膜中滞留菌形成的动态监测及其相关基因的初步筛选

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1、分类号：R781．4密级：⑧∥单位代码：10422学号：201013683菇办；硕士学位论文论文题目：白假丝酵母菌生物膜中滞留菌形成的动态监测及其相关基因的初步筛选D5‘andinitia一‘gofthegenesDynamicmonitoringandnitialscreenlnoftherelatedesoflgthepersistersemergingintheCandidaalbicansbiofilm合作导师2013年5月4日原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究

2、所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：整龋日期：趋!墨：皇：毕关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文

3、。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：盔蘧摘导师签名：主堕亟日期：趋丛主：上山东大学硕士学位论文白假丝酵母菌生物膜中滞留菌形成的动态监测及其相关基因的初步筛选专业口腔临床科学硕士研究生董洪楠导师亓庆国副教授中文摘要目的白假丝酵母菌(白色念珠菌)是人类常见的条件致病真菌，生物膜是包括其在内的几乎所有微生物在自然界中的生存方式，生物膜微生物具有超强耐药性。其可能机制包括：生物膜中胞外基质抗药物渗透的物理屏障作用、生物膜中菌株生长迟缓导致对药物的敏感性降低、基因突变耐药株的产生等，但这些不能完全解释生物膜耐

4、药性。2001年，Lewis等发现，铜绿假单胞菌生物膜中其实只有极少数菌株能够耐受较高浓度的药物作用且具有多药耐受性，因其耐药特征不具有遗传性，被称为“滞留菌或持留菌(Persisters)”。LewiS认为，这些菌株可能是生物膜耐药性的真正原因，并且与临床上常见的慢性反复性感染密切关联，但其形成机制尚不清楚。2006年，Lafleur等发现白假丝酵母菌中也存在“滞留菌”，但与细菌滞留菌不同的是，白假丝酵母菌滞留菌只存在于生物膜状态。本实验首先进行白假丝酵母菌生物膜中滞留菌形成的动态监测，分析白假丝酵母菌生物膜

5、中滞留菌产生的形成特点，确定滞留菌产生比例变化较大的两状态；进一步运用SSH(抑制性消减杂交)方法筛选两状态之间差异表达基因，即可能与滞留菌产生有关的基因，为下一步寻找滞留菌产生相关基因、揭开其产生机制及相关途径奠定基础。材料和方法(1)白假丝酵母菌生物膜中滞留菌形成的动态监测及分析分别以两相型白假丝酵母菌标准菌液构建体外生物膜模型，CFU计数法统计不同时间段生物膜加药前真菌细胞繁殖数目及加药后滞留菌产生数目，确定滞留菌产生数目变化较大的两状态；结合激光共聚焦显微镜(CLSM)，观察生物膜形山东大学硕士学位论文

6、态变化，分析滞留菌产生的影响因素。(2)SSH方法构建白假丝酵母菌两状态之间eDNA消减文库，初步筛选滞留菌产生相关基因运用SSH(抑制性消减杂交)技术，针对上一步得出的白假丝酵母菌两状态之间进行双向杂交，分别筛选出两状态之间差异表达的基因，经克隆扩增、PCR方法鉴定重组质粒，随机挑选阳性克隆进行测序，并在GenBank数据库中进行同源性比较。缸士申三日木(1)两相型菌液形成的不同时间段生物膜，真菌细胞繁殖数目及滞留菌数目均无显著差异。其中，真菌细胞繁殖数目呈“S"形生长，12h后渐稳定；滞留菌0．5h即大量产

7、生，2h后数目已基本稳定，此时镜下生物膜处于微菌落始形成期。(2)消减文库构建成功。经鉴定，文库获得EST片段平均插入片段在300bp-600bp左右，重组率大于95％，正反向消减文库的容量分别为2800和2600个；其中，正反向文库分别挑选200个阳性克隆子测序，共获得388条有效EST,聚类拼接后得到238条单基因簇(unigenes)，包括53个重叠群(comigs)帮l185个单拷贝(singlets)。结论(1)白假丝酵母菌滞留菌的形成与其生物膜形成初期(2h内)附着表面的诱导密切相关，而与其生物膜成

8、熟程度及两相型状态无显著关联。(2)SSH方法是快速筛选差异表达基因的有效方法，我们获得的eDNA消减文库为后续研究滞留菌产生机制及相关基因功能奠定了基础。[关键词]动态监测；白假丝酵母菌生物膜；滞留菌；SSHDynamicmonitoringandinitialscreeningoftherelatedgenesofthepersistersemergingintheCandidaa