蓬灰对糖尿病大鼠糖代谢的影响

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分类号：R5学位代码：10752密级：公开学号：2010198宁夏医科大学硕士研究生学位论文蓬灰对糖尿病大鼠糖代谢的影响TheEffectofPeng-huionglucose-metabolismindiabeticrats学位申请人：强丹指导教师：谢晓敏副教授申请学位类别：医学专业领域名称：内科学研究方向：糖尿病所在学院：临床医学院论文完成日期：二〇一三年九月宁夏医科大学研究生院万方数据 NingxiaMedicalUniversityThesisforApplicationofMaster’sDegreeTheEffectofPeng-huionglucose-metabolismindiabeticratsStudent’sName:QiangdanSupervisor：XiexiaominSubjectCategory:MadicineMajor:InternalMadicineSpecialty:DiabetesMellitusCollege:DepartmentofClinicalMadicineCompletionDate:Supt.2013I万方数据 宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何他人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名论文导师签名年月日年月日宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵循此规定）论文作者签名论文导师签名年月日年月日II万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文中文摘要蓬灰对糖尿病大鼠糖代谢的影响摘要目的采用高脂高糖饲料喂养的SD大鼠给予腹腔注射小剂量链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）制作糖尿病模型，给予不同剂量的蓬灰喂养8周，通过观察蓬灰对糖尿病大鼠糖代谢、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、胰腺组织HE染色的病理情况、胰腺及骨骼肌IRS-1表达等指标的变化，探索性研究蓬灰对糖尿病大鼠糖代谢影响的可能机制。方法雄性SD大鼠高脂高糖饲料喂养8周后，腹腔注射小剂量STZ（35mg/kg），1周后测大鼠空腹血糖，血糖值≥16.7mmol/L为造模成功大鼠54只，成模后将大鼠随机分为糖尿病对照组、蓬灰低剂量组、中剂量组和高剂量组。低、中、高剂量组分别灌胃给予50、100、150mg/kg蓬灰，另设正常对照组6只。正常对照组及糖尿病对照组每只每日给予等量生理盐水灌胃，共饲养8周。饲养期间，监测空腹血糖（FBG）、空腹体重。于饲养8周时，处死所有大鼠，取血清测定空腹血糖（FBG），空腹胰岛素(FINS)、C肽、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）变化。计算胰岛素抵抗指数（IRI）。取胰腺组织进行HE染色，计算炎性细胞计数。取胰腺及后肢股四头肌组织，应用免疫组化的方法检测大鼠胰腺及骨骼肌IRS-1的表达情况。结果本实验采用高脂高糖饮食加小剂量STZ诱导的糖尿病SD大鼠，监测血糖、IRI较正常对照组明显升高，胰岛素、C肽显著下降，符合2型糖尿病的病理生理特点。糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组大鼠空腹血糖较正常对照组比明显升高，有统计学意义（*P<0.05）；糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组大鼠空腹体重、空腹胰岛素、C肽较正常对照组明显降低，有统计学意义（*P<0.05）；中、高剂量蓬灰组大鼠胰岛素抵抗指数较正常、糖尿病对照组明显升高，有统计学意义（*P<0.05）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）各组间均无统计学差异（P>0.05）。糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组大鼠较正常对照组胰腺组织炎性细胞计数均增多，有统计学意义（*P<0.05）。高剂量蓬灰组大鼠较糖尿病对照组胰腺组织中炎性细胞计数升高，有统计学意义(△P<0.05)。糖尿病对照组、低、中、III万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文中文摘要高剂量蓬灰组大鼠较正常对照组大鼠胰腺和骨骼肌组织中IRS-1表达显著减少（*P<0.05）；高剂量蓬灰组大鼠的胰腺和骨骼肌组织中IRS-1表达水平均低于糖尿病对照组(△P<0.05)光镜下，糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组大鼠胰腺组织胰岛细胞减少、萎缩、腺泡组织血管扩张充血，周围炎性细胞浸润；骨骼肌细胞的部分肌原纤维排列紊乱，可见嵴溶解、断裂。结论1、蓬灰可能会加重糖尿病雄性SD大鼠胰岛素抵抗程度，对血糖无统计学差异。2、蓬灰可引起糖尿病SD大鼠胰腺腺泡组织血管扩张充血，周围炎性细胞浸润，可能会加重糖尿病SD大鼠的慢性低度炎症。3、蓬灰可能会抑制糖尿病大鼠胰腺和骨骼肌组织中IRS-1表达水平，进一步加重胰岛素抵抗程度。关键词SD大鼠，链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠，蓬灰，血糖，胰腺，骨骼肌，胰岛素受体底物-1IV万方数据 宁夏医学院硕士研究生学位论文英文摘要TheEffectofPeng-huionglucose-metabolismindiabeticratsABSTRACTObjectivesThemodelofdiabeticratswasestablishedbyhighfatandsugardietfeedingcombinedwiththeintravenousinjectionofasmalldoseofinjectionofstreptozotocin(Streptozocin,STZ).ThestudyistoinvestigatemechanismofPeng-huieffectonmodelofdiabetesratsonglucosemetabolism,tumornecrosisfactor-α(TNF-α),pancreatictissueinflammatorycellcount,pancreasandskeletalmuscleexpressionofIRS-1andotherindicators,toexploreitsimpactonbloodsugarfluctuationspartmechanismforthepreventionandtreatmentofdiabetesmayprovideabasis.MethodsMaleSDratswerefedwithhighfatandsugarafter8weeks,intraperitonealinjectionofsmalldosesofSTZ(35mg/kg),1weekmeasuredfastingbloodglucose,bloodglucose≥16.7mmol/Lforthesuccessfulmodelrats54,intoamoldaftertheratswererandomlydividedintodiabeticcontrolgroup,Peng-huilowdosegroup,middledosegroupandhighdosegroup.Low,mediumandhighdosegroupweregivenorally50,100,150mg/kgPeng-hui,andnormalcontrolgroup.Normalcontrolgroupanddiabeticcontrolgroupgivennormalsalineorallyperday,atotalof8weeks.Duringthefeeding,fastingbloodglucosemonitoring(FBG),fastingweight.At8weeks,theratsweresacrificed,serumfastingbloodglucose(FBG),fastinginsulin(FINS),C-peptide,tumornecrosisfactor-α(TNF-α)changes.Insulinresistanceindex(IRI).HEstainingofpancreatictissuetakentocalculateinflammatorycellcounts.Pancreasandhindlimbquadricepstissue,immunohistochemistrywasusedtodetectratpancreasandskeletalmuscleIRS-1expression.ResultsThelevelsofbloodglucose,,IRIofthediabeticratsfedwithhigh-fat-high-sugarandjnjectedwithasmalldoseSTZweremarkelyincreasedascomparedwiththoseofthenormalcontrolgroup.Insulin,C-peptideofthediabeticratswasreducedascomparedwiththatofthenormalcontrolgroup.Thoseaccordedwiththefeatureofdiabeticpathogenesisandbiochemistry.Diabeticcontrolgroup,low,V万方数据 宁夏医学院硕士研究生学位论文英文摘要mediumandhighdosePeng-huiratscomparedwithnormalfastingbloodglucosewassignificantlyhigherthanthecontrolgroup,therewasstatisticallysignificant(*P<0.05);diabeticcontrolgroup,low,mediumandhighdosegroupsPeng-huifastingbodyweight,fastinginsulin,C-peptidewassignificantlylowerthanthenormalcontrolgroup,therewasstatisticallysignificant(*P<0.05);mediumandhighdosePeng-huiratinsulinresistanceindexthannormal,diabeticcontrolgroupweresignificantlyincreased,therewasstatisticallysignificant(*P<0.05);tumornecrosisfactor-α(TNF-α)werenotstatisticallydifferentbetweenthegroups(P>0.05).Diabeticcontrolgroup,low,mediumandhighdosePeng-huiratscomparedwithnormalcontrolgroup,pancreatictissueinflammatorycellcountswereincreased,therewasstatisticallysignificant(*P<0.05).Peng-huihigh-dosegroupthanthecontrolgroup,diabeticpancreatictissueinflammatorycellcountincreased,withstatisticalsignificance(△P<0.05).Peng-huihigh-doseratspancreasandskeletalmuscletissueexpressionofIRS-1levelswerelowerthanthediabeticcontrolgroup(*P<0.05)underthelightmicroscope,diabetescontrol,low,mediumandhighdosePeng-huiratspancreaticisletcellsdecreased,atrophy,acinartissuevasculardilatationandcongestion,peripheralinflammatorycellinfiltration;skeletalmusclecellspartmyofibrilsdisorganized,visiblecrestdissolvedfracture.Conclusion1.Peng-huidiabeticmaleSDratshadnoeffectonbloodsugarmay,insulinresistanceindexwassignificantlyincreased.2.Peng-huicancausediabeticSDratpancreaticacinartissuevasculardilatationandcongestion,peripheralinflammatorycellinfiltration,mayaggravatediabeticSDrats,chroniclow-gradeinflammation.3.Peng-huicanreducetype2diabeticratpancreasandskeletalmuscleIRS-1expressionlevelsandfurtheraggravateinsulinresistance.KEYWORDSSDrats,streptozotocin-induceddiabeticrats,Peng-hui,bloodsugar,thepancreas,skeletalmuscle,insulinreceptorsubstrate-1VI万方数据 宁夏医学院硕士研究生学位论文符号说明中英文缩略词英文缩写英文全称中文全称FBGfastbloodglucose空腹血糖FINSfastingplasmainsulin空腹胰岛素GTFGlucosetransportfactors葡萄糖转运因子GTFglucosetolerancefactor葡萄糖耐量因子IRSInsulinreceptorsubstrate胰岛素受体底物IRS-1Insulinreceptorsubstrate-1胰岛素受体底物-1BMIbodymassindex体重指数ILInterleukin白细胞介素TNF-αtumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子-αDNAdesoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸Minminute分钟hhour小时ssecond秒Sstandarddeviation标准差ISAInorganicarsenic无机砷IRInsulinresistance胰岛素抵抗RosReactiveoxygenspecies活性氧簇OFROxygenfreeradical氧自由基DMDiabetesmellitus糖尿病RNSactivenitrogen活性氮Igintragastric灌胃HEhematoxylin-eosin苏木精-伊红PBSphosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲溶液Lepleptin瘦素VII万方数据 宁夏医学院硕士研究生学位论文符号说明PI3-Kphosphatidylinositol3-kiase磷脂酰肌醇3-激酶VIII万方数据 宁夏医学院硕士研究生学位论文目录目录一、正文………………………………………………………………1前言………………………………………………………………1材料与方法………………………………………………………3结果………………………………………………………………12讨论………………………………………………………………16结论………………………………………………………………24附图………………………………………………………………25参考文献…………………………………………………………28二、综述………………………………………………………………33综述参考文献……………………………………………………45致谢……………………………………………………………………50攻读学位期间发表的学术论文………………………………………51个人简历………………………………………………………………52IX万方数据 宁夏医学院硕士研究生学位论文前言前言糖尿病是一组病因和发病机制尚未完全阐明的以慢性血葡萄糖水平增高为特征的内分泌代谢性疾病。糖尿病的病因和发病机制目前尚不明确。其显著的病理生理学特征为胰岛β细胞功能缺陷所导致的胰岛素分泌减少（或相对减少）和或胰岛素抵抗所导致的胰岛素在机体内调控葡萄糖代谢能力的下降。低度炎症状态参与了胰岛素抵抗的发生、发展，其中包括大量由免疫细胞和脂肪细胞分泌的炎性介质，如：肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、瘦素等。近几年一些流行病学与实验研究的资料证实,胰岛素抵抗与炎症之间存在着一定的相关关系,推测炎症将可能成为促进胰岛素抵抗的一个重要因素。近年来，导致胰岛素抵抗的机制中以胰岛素细胞内信号转导障碍备受关注，经过研究证明，炎症因子可以干扰胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate,IRS)信号转导通路。胰岛素主要通过受体前、受体、受体后三个阶段发挥生物学效应，当这三个阶段任一出现异常时均会出现胰岛素抵抗。受体前阶段发生障碍，主要是胰岛素基因发生突变从而使其结构和功能出现异常，导致生物活性降低、丧失，胰岛素与其受体不能正常结合，出现障碍；受体阶段发生障碍，主要是受体结构和功能出现异常，受体数目减少以及亲和力下降；受体后阶段发生障碍，主要是胰岛素细胞内信号转导途径出现异常，在级联反应中，胰岛素信号的转导由多个信号分子共同参与，任意一个信号分子表达和（或）活性的改变都可能会影响胰岛素信号的[1,2]转导。研究发现，以受体后水平的变化最为多见，尤其与一些信号转导关键分子如：胰岛素受体底物-1、胰岛素受体、磷脂酰肌醇-3激酶的受损有关系，是引起胰岛素抵抗的主要分子机制。[3]蓬灰是由俗名为臭蓬蒿的野生植物烧结而成。臭蓬蒿学名为白茎盐生草，为中子目[3]黎科盐生草属的一年生草本植物，多生长在荒漠地区，富含多种盐类、生物碱以及多种金属元素如砷、铅、铝等。据有关文献报道，对正常SD大鼠给予蓬灰干预后，胰腺组织血[4]管明显扩张充血，与持续高血糖状态下糖毒性所致的胰腺组织损伤的病理状态相似，推测可能正常SD大鼠在持续摄入蓬灰后，其中的多种盐类、生物碱、砷、铅、铝等可加重胰腺损伤。砷与高血糖：砷主要以AsⅤ和AsⅢ两种化合价态存在。砷酸根在结构上与磷酸根具有1万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文前言一定的相似性，可以假乱真干扰磷酸根在物质与能量代谢中的作用，减慢葡萄糖的正常代[5]谢，破坏能量产生途径，妨碍了胰岛素分泌的作用。AsⅢ可与含-SH的蛋白质紧密结合使[6][7]其失去活性，从而发挥其潜在的细胞毒素基因毒素和酶抑制剂作用。已证实，长期接[8][9]触砷可以诱导糖尿病的发生。Tseng等研究发现，在台湾，高砷浓度蓄积接触和糖尿病之间存在的高发关系，即DM的发病率与接触砷化合物的浓度呈正相关。为了更加明确砷与[9][12]糖尿病的关系，Hui-FenChui和Daphnehuang。等分别在台湾和新疆高砷地区做进一步调查。通过检测发现居民血糖在高砷地区较非高砷地区水平明显升高，进一步表明砷可以诱导糖尿病的发生。铅、铝与高血糖：有动物实验研究证实：铅、铝能拮抗胰岛素的生物学作用故而降低其降血糖的作用，胰岛素用量超过正常的50倍时，才能抵消铅、铝对胰岛素降血糖的拮抗[11]作用。本研究拟通过建立糖尿病大鼠模型，给予不同剂量的蓬灰喂养8周，观察糖尿病大鼠体重、空腹血糖、空腹胰岛素、C肽、胰岛素抵抗指数、肿瘤坏死因子等指标的变化；观察糖尿病大鼠胰腺组织HE染色的病理变化；观察糖尿病大鼠胰腺、骨骼肌IRS-1的表达情况。探索性研究糖尿病大鼠持续喂养蓬灰8周后蓬灰对糖尿病大鼠生长情况、糖代谢变化及胰岛素受体底物信号转导通路的影响；探索性研究蓬灰对糖尿病大鼠糖代谢影响的可能机制。2万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法材料与方法1．实验材料1.1试验动物健康清洁级8周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠，体重(280±40)g，由宁夏医科大学动物实验中心提供。健康状况符合国家普通实验动物健康标准，检验合格，实验动物合格证：SCXK（宁）2005-0001，常规条件下饲养，自由饮水，普通饮食，环境温度控制在15~25℃，相对湿度控制在45%~55%，饲养环境保持清洁。实验前禁食12小时。1.2动物饲料采用宁夏医科大学实验动物中心统一配制的普通、高脂高糖饲料普通饲料的组成：玉米粉比例占30%、标粉比例占25%、麸皮比例占20%、鱼粉比例占10%、豆粉比例占10%、酵母粉比例占2%、食盐比例占1%、鱼肝油比例占1%、维生素添加剂比例占0.5%、微量元素添加剂比例占0.5%高脂高糖饲料的组成：基础饲料比例占55%、白糖比例占27%、猪油比例占16%、蛋黄比例占2.5%。1.3主要试剂及检测仪器材料来源蓬灰甘肃省兰州市甘肃力司食品科技有限公司胰岛素试剂盒河南省焦作市解放免疫诊断试剂研究所基础饲料宁夏医科大学动物实验中心80-2离心机上海手术器械厂-80℃低温冰箱山东青岛海尔集团电冰箱厂立式低温保存箱青岛海尔特种电器有限公司PHS-25实验室PH计上海理达仪器厂电子称(DS-671)上海寺岗电子有限公司制造药物架盘天平浙江省慈溪市天东衡器厂TDZ4-WS低速自动平衡离心机湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司3万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法FA-N/JA-N系列电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司移液器EppendorfCorporationSK-1快速漩涡混匀器江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司DMS200型紫外-可见光分光光度计美国Varian公司Model550酶标仪日本BIO-MED公司微量血糖测定仪美国强生公司STZ（批号：50130）美国Sigma公司大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA武汉基因美生物技术有限公司批号：86571C）IRS-1兔抗大鼠一抗北京博奥森生物技术有限公司生物素标记的羊抗兔二抗北京博奥森生物技术有限公司DAB试剂盒北京博奥森生物技术有限公司1.4手术用常规器械/HE染色器械/IRS-1免疫组化大鼠解剖台、无影灯、一次性无菌手套、洞巾、短有齿镊、长无齿镊、眼科镊、眼科剪、组织剪、线剪、无损伤血管钳、血管夹、持针器、蜡杯、解剖刀、解剖剪、解剖盘、培养皿、手术缝合针、无损伤缝合线、刀柄、刀片、纱布、棉球、小药杯、弯盘、1ml注射器、2.51ml注射器、5ml注射器、20ml注射器、石蜡、蜂蜡、苏木精染液、1%伊红酒精溶液、1%盐酸酒精溶液、吸耳球、备皮刀、蛇皮灯、精密移液器及一次性吸头、蒸馏水、一次性试管、吸水纸、切片刀、恒温箱、镊子、单面刀片、包埋盒、染色缸、盖玻片、载玻片、玻片盘、树胶、数胶瓶、显微镜、温度计、水溶锅、福尔马林、酒精、二甲苯、中性树胶。各种型号注射器、灌胃针等。1.5实验试剂0.9%氯化钠注射液（宁夏启元国药有限公司）；肝素钠注射液（江苏万邦生化医药股份有限公司，国药准字H32023409，批号：0907128）；10%水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司)；2．实验方法2.12型糖尿病大鼠模型的建立4万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法把全部SD大鼠用普通饲料进行为期1周的适应性喂养，再按照随机的方法分成两组，一组为正常对照组（6只）、二组为造模组（60只），分别给予普通饲料和高脂高糖饲料喂养。8周后分次注射小剂量链脲佐菌素（STZ）35mg/kg，糖尿病成模以随机血糖≥16.7mmol/l为标准，将造模失败的大鼠丢弃，造模成功组的大鼠为54只，此后造模成功组大鼠（54只）与正常对照组大鼠（6只）均采用普通饲料喂养。2.2蓬灰干预阶段蓬灰用温开水按1：4溶解后小心弃出上清，弃去不溶成分。造模成功的糖尿病SD大[13][14]鼠采取随机的方法分成糖尿病对照组和低、中、高剂量蓬灰组。各蓬灰组采用文献结合预实验分别给予50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg蓬灰溶液灌胃8周，每日一次。对照组给予生理盐水。于0周、2周、4周、8周时禁食（不禁饮）约12h，测空腹血糖（FBG），体重，于8周时禁食（不禁饮）约12h，取血并分离血清后于零下80℃冻存，备测空腹胰岛素（FINS）、C肽、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；取胰腺组织及后肢股四头肌固定后备用。截止整个实验结束，共有18只SD大鼠由于操作过程中灌胃损伤、尾静脉采血创面感染，zhikuquan20150721心脏采血失败、低血糖反应、糖尿病酮症酸中毒等原因造成死亡。2.3血糖测定本实验采用葡萄糖氧化酶法，利用强生血糖仪和同批次血糖试纸测量。葡萄糖氧化酶法为：葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用→葡萄糖酸+H202+4-氨基安替比林+酚→O2+有色化合物。有色化合物颜色深浅同血糖浓度成正比。2.3.1所有大鼠禁食12h后，用酒精消毒大鼠尾巴，用剪刀从尾巴末梢处断尾取血后采用强生公司稳豪血糖仪和同批次试纸，微量法测定静脉全血葡萄糖，记录数据。FA-N/JA-N系列电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）称量大鼠体重。压迫鼠尾数分钟止血后，用酒精棉球消毒并清洁伤口后放回笼中。2.4胰岛素测定使用血清胰岛素放射免疫分析法2.4.1胰岛素放射免疫分析药盒实验原理实验表明使用放射免疫分析法测定，首先在取样的样品中将胰岛素和胰岛素抗血清产5万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法生的竞争结合进行标记，而后，等待实验反应达到稳定平衡，接着向样品中加入定量的分离剂，从反应的体系中把胰岛素分离出来，同时计算胰岛素的放射性计数，依据此计数和标准曲线从而得出样品中胰岛素的含量。计算胰岛素抵抗指数IRI=Ln[(空腹血糖×空腹胰岛素)/22.5]。2.4.2试剂盒组成：1、标准品:6瓶（冻干品）（如是液体可直接使用）每瓶都要添加1ml缓冲溶液溶解，浓度分别为5、10、20、40、80、160μIU/ml。2、抗体：1瓶（冻干品，蓝色）100管用10.5ml蒸馏水溶解（50管用5.5ml蒸馏水溶解，如是液体可直接使用）。3、125I标记物：摇匀后直接使用1瓶（液体，红色）。它的放射活度1.4μci。4、分离剂：摇匀后直接使用1瓶（液体，绿色）。5、缓冲液：直接使用1瓶（液体）。2.4.3操作步骤：zhikuquan20150721取若干个圆底聚乙烯管，具体标记为：S0管、S1~S6管、NSB管和待测样品管。加样、操作的具体步骤如下。（单位：μl）试剂名称NSB管S0管S1~S6管样品管缓冲液200100————标准品————100——待测血样——————100抗血清——100100100125I-ins——100100100摇匀，37℃2小时分离剂500500500摇匀，室温15分钟6万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法再任意取样三支管测总放射性计数T，离心15分钟，3500转/分，把上面的清液吸入弃之，测算各管放射性计数（CPM）。2.5大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA本试剂盒用于测定大鼠血清，细胞上清及相关液体样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。2.5.1实验原理：该试剂盒主要使用双抗体夹心法对标本中大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平进行测定。将大鼠肿瘤坏死因子（纯化的）抗体与羊抗鼠抗体（HRP标记的）结合，从而产生抗体-抗原-酶标抗体复合物，通过洗涤出现TMB显色，而后与HRP酶发生作用转变为蓝色，接着与酸发生作用转变为黄色。这些颜色的深与浅和TNF-α的浓度成正比。用酶标仪在测定吸光度（在450nm波长下），依据标准曲线进而计算出样品中大鼠TNF-α的浓度，乘以5倍，即TNF-α实际浓度。2.5.2试剂盒组成：zhikuquan20150721试剂盒组成有酶标包被板显色剂A、B液标准品稀释液样品稀释液浓缩洗涤液等。2.5.3样本处理及要求：1.血清：取出血清自然状态下静置15分钟离心后收集上清液，如离心不完全，可再次离心。把收集的上清液标记，备用。2.血浆：同血清，需要使用抗凝管。取出血清自然状态下静置15分钟离心后收集上清液，如离心不完全，可再次离心。把收集的上清液标记，备用。3.尿液：此次试验主要使用血清做标本，未进行尿检。4.采集血清，血液有凝固的特点，采集血清选用常规试管，提取后血清后应尽快进行实验。如需做多个实验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冰冻和融化。5.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性[11]2.5.4操作步骤：严格按照说明书操作（详见说明书）2.6胰腺组织常规HE染色HE染色是石蜡切片技术中最为常用的一种染色法，俗称苏木精-伊红染色，苏木精为7万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法碱性染液，该染液可以把细胞核内的染色质与胞质内的核糖体染成紫蓝色，有嗜碱性；染料伊红为酸性，该染料可以使将细胞质和细胞外基质中的成分染成红色，有嗜酸性。应用Imagine-proplus6.0图像分析系统，每张切片随机读取视野拍摄5张照片后，对每张照片进行炎性细胞计数。2.6.1取材与固定分别从鼠笼中取出大鼠后称重，之后以10%水合氯醛1.5ml/kg用5ml注射器经腹腔注射麻醉。将麻醉后的大鼠固定于实验台上后，打开腹腔分离并取出胰腺（5mm×5mm×2mm），后肢骨骼肌组织，滤纸吸干水分后以10%多聚甲醛固定24h备用。2.6.2试剂配置伊红酒精溶液（0.5-1%）；称取伊红Y0.5-1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精100毫升软溶解。苏木精染液配方：将苏木精溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。zhikuquan201507211、苏木精6g2、无水乙醇100ml3、硫酸铝钾150g4、蒸馏水2000ml5、碘酸钠1.2g6、冰醋酸120ml7、甘油900ml8、盐酸酒精分化液（1%）：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中。2.6.3脱水透明将固定的胰腺组织切下一小块（2-3mm厚）装入标本盒中，将标注低浓度到高浓度的酒精进行脱水（依次经过70%、80%、90%酒精）各取30min，慢慢将组织块中的水分脱去。再把组织块放于95%、100%酒精中各2次，每次20min。然后溶解在透明剂二甲苯中和等量纯度酒精混合液中透明，用二甲苯替换出组织块中的酒精，到透明结束。8万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法2.6.4浸蜡包埋在已融化的石蜡中放入透明的组织块，在融蜡箱中保温。包埋步骤等石蜡完全浸入组织块后进行；准备好容器，倒入刚才已融化好的石蜡，迅速将夹取已浸透石蜡的组织块放入在里面，冷却凝固成块状。2.6.5切片与贴片在切片机的夹物台上将固定和修好的石蜡块装上。刀架上固定好切片刀，刀口向上。摇推螺旋，将刀口与石蜡块贴近，但不能超过刀口。调整刀口和石蜡块之间的位置和角度，刀片与石蜡切片大约成15度角。把调整厚度的调节器调整到适合的厚度（4-10μm）。右手摇动转轮，把蜡块切成蜡带，左手拿着毛笔将蜡带托起来。将蜡带切成20cm左右，右手用毛笔轻轻挑起蜡带并牵引成带，把它平放在蜡带盒上，靠着刀面方向朝下。用取出蜡片一小段使用单面刀片完成，放在载玻片上加一滴水，然后放置在显微镜下观察切片。打开水温保持在40-45℃的水浴锅，准备好30%酒精溶液。切片的时候，将30%的酒精溶液放在一边桌上。然后用小镊子夹取刚才刀片割开的蜡带，将其放置在酒精溶液的水面上，然后切zhikuquan20150721片展开。用小镊子把连在一起的切片分开来，用一个载玻片，把刚才已经展开的切片捞进温水里，使它充分展开。捞起展开的切片，另取洁净的载玻片，使其放置位于1/3处，另一端磨面上把标签贴上，放于切片架上。2.6.6脱蜡染色把水浴锅温度调节到60℃，等水温保持控制在60℃时，把切片和切片架一起放入一个干燥的染色缸里，放进水浴锅里，盖好盖子，30min，等到蜡融化。然后石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min脱去切片中的石蜡，然后放入100%酒精溶液、95%酒精溶液、90%酒精溶液、80%酒精溶液、70%酒精溶液各5分钟，最后放入蒸馏水中3分钟洗净。2.6.7具体步骤1、二甲苯（Ⅰ）（Ⅱ）浸泡15min2、100%乙醇（Ⅰ）（Ⅱ）浸泡5min3、80%乙醇浸泡5min4、蒸馏水浸泡5min9万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法5、苏木精液染色浸泡5min6、流水稍洗去苏木精液浸泡1-3s7、1%盐酸乙醇浸泡1-3s8、稍水洗10-30s9、促蓝液返蓝10-30s10、流水冲洗浸泡10-15min11、蒸馏水过洗1至2s12、0.5%伊红液染色1至3min13、蒸馏水稍洗1至2s14、80%乙醇稍洗1至2s15、95%乙醇（Ⅰ）2至3s16、95%乙醇（Ⅱ）3至5s17、无水乙醇浸泡5-10minzhikuquan2015072118、石炭酸二甲苯浸泡5-10min19、二甲苯（Ⅰ）浸泡2min20、二甲苯（Ⅱ）浸泡2min21、二甲苯（Ⅲ）浸泡2min以透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固中性树胶。等树胶稍微干一些，在贴上标签，做标记，做成可使用的切片标本。2.7胰腺及骨骼肌组织IRS-1的表达2.7.1原理：用阳性切片进行阳性对比，将磷酸盐缓冲液取代一抗进行阴性对比。一抗的稀释浓度为1:300。2.7.2操作步骤：制作切片参照HE染色法，切片制作完毕后蒸馏水冲洗，PBS液冲洗，抗原修复。将高压锅内1000ml的柠檬酸修复液加热沸腾，让切片完全浸入并盒盖，加热至两分钟后，自然冷却至室温。冷蒸馏水冲洗，PBS液冲洗。如果需要，可进行复染，脱水，透明。10万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法2.8免疫组化图像分析在高倍镜视野下（×400）观察骨骼肌和胰腺组织中IRS-1表达，应用Imagine-proplus6.0图像分析系统进行半定量分析，经标准灰度校正后，每张切片随机读取视野拍摄5张照片后，对每张照片进行细胞计数，细胞浆和细胞膜染色为棕黄色判断为阳性，评分方法：无色为阴性（-）0分；浅黄色为弱阳性（+）1分；黄色为中等阳性（++）2分；褐色为强阳性（+++）3分，然后将细胞计数得分与染色评分相乘计为综合得分。＜1.0为弱阳性；1.0~1.5为中等阳性；＞1.5为强阳性。3统计学处理数据处理分析应用SPSS16.0统计软件进行，数据用±s表示，偏态分布的胰岛素取以自然为底的对数后进行分析，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两组间样本均数采用T检验进行统计学分析，以P<0.05为有统计学差异。zhikuquan2015072111万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文结果结果1、蓬灰含量分析本次实验所使用蓬灰经检测：生物碱占87%(其中Na2CO3占70%K2CO3占5%)、砷0.002mg/kg、铝10mg/kg、铅0.08mg/kg及少量微量元素钙、镁等（日立Z-2000型原子吸收光谱仪宁夏大学实验室）。2、一般情况（见表1）表1正常SD大鼠、糖尿病SD大鼠的一般状况比较一般情况正常SD大鼠糖尿病SD大鼠精神状态良好萎靡毛发有光泽无光泽，干燥易脱落活动灵活、自如迟缓体重（g）485.50±37.52385.50±104.80P<0.05大便zhi成形黄软便kuquan20150721稀软便和硬便交替出现眼睛明亮有明显白内障3、低、中、高剂量组蓬灰的血糖进行比较（见表2）0周时，糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组血糖明显高于正常对照组，有统计学差异（*P<0.05）；2周时，糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组血糖明显高于正常对照组，有统计学差异（*P<0.05），高剂量蓬灰组血糖低于低剂量蓬灰组，有统计学差异。（#P<0.05）；4周时，糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组血糖明显高于正常对照组，有统计学差异（*P<0.05），中剂量蓬灰组血糖低于低剂量蓬灰组有统计学差异。（#P<0.05）；6周时，糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组血糖明显高于正常对照组，有统计学差异（*P<0.05），低、中剂量蓬灰组血糖低于高剂量蓬灰组有统计学差异（△P<0.05）；8周时，糖尿病对照组、低、中、高蓬灰组血糖明显高于正常对照组，有统计学差异（*P<0.05），各蓬灰组间血糖无统计学意义（P>0.05）。12万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文结果表2低、中、高剂量组蓬灰的血糖进行比较（x±s）。数量血糖（mmol·L-1）组别（只）0周2周4周6周8周正常对照组64.05±0.487.80±3.246.47±1.176.00±0.605.50±1.38糖尿病625.75±5.89*****24.37±9.0723.35±10.5921.57±11.4325.23±10.95对照组低剂量组****△*1024.46±4.2128.69±6.6329.75±4.4330.23±6.3420.26±8.89中剂量组***#*△*1025.84±4.8424.81±7.3322.71±8.4626.32±8.5625.59±7.96高剂量组**#***1024.09±3.3119.35±8.8328.16±5.4817.49±10.9022.29±9.65#注：与正常对照组比较*P<0.05;与低蓬组比较P<0.05；与高蓬组比较△P<0.05；表3低、中、高剂量组蓬灰的体重进行比较（x±s）数量体重（g）组别（只）0周2周4周6周8周正常对照组6291．00±39.56337.50±36.94438.33±36.01460.83±38.67485.50±37.52**#△*#糖尿病对照组6351.33±32.01374.50±38.52393.33±61.21390.83±83.45385.50±104.80***低剂量组10333.00±32.85334.00±40.19337.00±50.92312.20±56.05293.10±66.43***中剂量组10311.20±54.20342.33±46.98346.80±57.19333.80±53.37324.40±63.84***#*#高剂量组10344.00±42.28356.50±33.67374.50±34.03367.80±45.61372.80±70.45注：与正常对照组比较*P<0.05;与低蓬组比较#P<0.05；与中蓬组比较△P<0.05；4、低、中、高剂量组蓬灰的体重进行比较（见表3）0周时，糖尿病对照组、高剂量蓬灰组体重均高于正常对照组，有统计学差异（*P<0.05）；2周时，各组间体重均无统计学差异（P>0.05）；4周时，低、中、高剂量蓬灰组体重均低于正常对照组，有统计学差异（*P<0.05）；6周时，糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组体重均低于正常对照组，有统计学差异（*P<0.05），糖尿病对照组、高剂量蓬灰组体重均高于低剂量蓬灰组，有统计学差异（#P<0.05）；糖尿病对照组体重高于中剂量13万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文结果蓬灰组，有统计学意义（△P<0.05）8周时，糖尿病对照组、高剂量蓬灰组体重均低于正常对照组，有统计学差异（*P<0.05），糖尿病对照组、高剂量蓬组体重高于低剂量蓬组，有统计学差异（#P<0.05）。5、各组8周空腹血糖、空腹胰岛素、C肽、胰岛素抵抗指数、肿瘤坏死因子的比较（见表4）表4各组8周空腹血糖、空腹胰岛素、C肽、胰岛素抵抗指数、肿瘤坏死因子的比较（x±s）数量空腹胰空腹血糖C肽胰岛素抵抗肿瘤坏死因分组（只岛素(mmol/L)（ng/ml）指数子（fmol/ml））（mIU／L）正常对照组65.50±1.384.02±0.533.05±1.141.73±0.83191.31±10.77***糖尿病对照组625.23±10.953.11±0.471.14±1.114.52±3.37200.71±31.90***低剂量组1020.26±8.892.38±0.470.97±1.324.99±3.38203.00±62.90****中剂量组1025.59±7.962.96±0.681.08±0.748.32±4.79180.67±39.17****高剂量组1022.29±9.652.90±0.691.16±0.606．21±5.23183.15±28.19注：与正常对照组比较*P<0.05;与正常对照组比较，糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组大鼠空腹血糖明显升高，有统计学意义（*P<0.05）。与正常对照组比较，糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组大鼠空腹胰岛素有下降趋势，有统计学意义（*P<0.05）；与正常、糖尿病对照组比较,中、高剂量蓬灰组大鼠胰岛素抵抗指数明显升高有统计学意义（*P<0.05）。；与正常对照组比较，糖尿病对照组、低、中、高蓬灰组大鼠C肽均有减少趋势，有统计学意义（*P<0.05）。各组间肿瘤坏死因子（TNF-α）均无统计学差异（P>0.05）。6、各组胰腺组织HE染色炎性细胞计数比较。（见表5，图1）与正常对照组比较，糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组大鼠炎性细胞计数均增多，有统计学意义（*P<0.05）。与糖尿病对照组比较，高剂量蓬灰组的胰腺组织中炎性细胞计数高于糖尿病对照组(△P<0.05)。14万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文结果表5各组胰腺泡组织中炎性细胞计数（x±s）分组数量（只）炎性细胞计数(个)正常对照组64.86±2.67*糖尿病对照组629.45±10.57低剂量组1031.56±11.78**中剂量组1032.67±13.45高剂量组1045.34±15.61*△注：与正常对照组比较*P<0.05;与糖尿病对照组比较△P<0.05；7、各组大鼠骨骼肌和胰腺IRS-1表达水平的比较（见表6，图2，图3）与正常对照组比较，糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组大鼠IRS-1的表达均减少，有统计学意义（*P<0.05）；与糖尿病对照组比较，高蓬组的胰腺和骨骼肌组织中IRS-1表达水平均低于糖尿病对照组(△P<0.05)(见表6)表6各组大鼠骨骼肌和胰腺IRS-1表达（x±s）分组数量（只）骨骼肌胰腺正常对照组61.62±0.091.63±0.04**糖尿病对照组60.98±0.051.10±0.08低剂量组100.89±0.05**1.03±0.06中剂量组100.76±0.06**0.96±0.03高剂量组100.52±0.09*△*△0.76±0.07F26.93025.453注：与正常对照组比较*P<0.05；与糖尿病对照组比较△P<0.05；15万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文讨论讨论1、实验性糖尿病大鼠模型的建立建立糖尿病大鼠模型对研究糖尿病的病理生理机制、慢性并发症及新型药品的研究和发展等方面意义重大。国际国内以往采用的糖尿病SD大鼠的建模主要有两种方法，其中一种是采用纯种近交系且有糖尿病遗传倾向的动物，如肥胖大鼠（Wistar）、大鼠（OLEFT）和小鼠（ob/ob）等等；另一种方法是使用STZ(大剂量)和四氧嘧啶等化学制剂诱导形成。第一种方法由于受到获取动物、喂养方式、生育条件和昂贵的实验所需经费的限制，遗传因素在发病过程中具有主导作用。第二种方法主要使用较大剂量STZ（＞50mg/kg）或四氧嘧啶损伤大鼠胰岛β细胞，从而严重阻碍大鼠胰岛素的合成与分泌，其形成的糖尿病的改变更接近于1型糖尿病，其缺点是造成大鼠的死亡率较高。以上两种建模法都与糖尿病的致病机理不符，其研究存在一定的局限性。[15]本实验糖尿病大鼠模型的建立主要依据文献所述方法及建模成功的判断标准实施。实验所采用的雄性SD大鼠经饲料（高脂高糖）饲养8周，引发IR，在SD大鼠空腹腹腔中注射小剂量的STZ，导致SD大鼠部分胰岛β细胞受损，其胰岛素分泌失代偿，导致血糖升高。本实验成模率为90%，建好的糖尿病大鼠模型的临床表现主要有多饮、尿频、贪食及体重明显下降。成模后糖尿病大鼠血清学主要变化有血糖升高、胰岛素水平、C肽水平下降及胰岛素抵抗加重；病理学外观变化表现为精神状态萎靡，毛发干燥，无光泽。活动迟缓，眼睛有白内障，大便稀塘或便秘。和人患糖尿病的过程、生化代谢和临床表现特点类似，属于糖尿病大鼠模型的范畴。本实验成模率较高，主要因素有以下几方面：1、成模前，喂养过程中每一笼养五只大鼠，温度控制在15~25℃，湿度保持在45%~55%，自由取食、进水，光照周期为12个小时。这个阶段每三日进行一次清理。成模后，正常对照组的鼠笼仍坚持每三日清理一次，糖尿病组的鼠笼每日清理一次。2、灌胃时注意人为因素损伤。3、使用小剂量的STZ造成部分胰腺组织损伤。4、监测血糖时采用尾巴末梢处断尾取血，压迫止血，且处理创面，预防感染。2、蓬灰对糖尿病大鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数的影响[3]蓬灰是由俗名为臭蓬蒿的野生植物烧结而成。臭蓬蒿学名为白茎盐生草，为中子目16万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文讨论[4]黎科盐生草属的一年生草本植物，多生长在荒漠地区，富含多种盐类、生物碱以及多种金属如砷、铅、铝等。如在体内蓄积可导致中毒，尤其是环境砷暴露与糖尿病发生关系密切。（1）砷与糖尿病的流行病学国外研究发现，砷与糖尿病关系密切，发现在高砷地区，糖尿病发病率明显增加，在低砷地区明显降低，在中国贵州省病区主要为燃烧煤后，空气污染，砷含量增加导致砷中毒。其他地区以饮用水砷中毒为主。根据流行病学调查，慢性长期接触砷可以引发糖尿病，[16][17]特别是2型糖尿病。早在2000年，Tseng等开展流行病调查，发现在台湾居民饮用的受砷污染的水域中，随着时间和砷化合物浓度的增加糖尿病的发病率就会增加;砷浓度依赖[18]性蓄积接触和糖尿病的发生成正相关;2008年Daphnehuang等，他们在新疆地下水砷含量达到0.85mg/L的地区开展流行病调查，在对血糖检测的结果分析发现，高砷地区的血[19]糖检测值明显高于正常对照组。在中国大陆地区，从流行病学和2002年Tseng等研究，2型糖尿病与接触砷密切相关，随着接触砷时间延长，糖尿病发病率在增加。推测砷导致糖尿病的可能机制包括以下几个方面：（2）砷的代谢毒性和特性人摄取砷的主要来源是饮水和进食，食物中含有机砷及无机砷，水中则含有化合价态1-3-3+5+的无机砷，如As、As、As和As。人们从土壤和进食的食物中摄入砷的量是很低的，但农民由于长期接触土壤，砷暴露危险性增加;同时，工业砷导致污染也不可低估,比如制造半导体的工人就长期暴露在充满砷化镓的环境中。砷主要包含AsⅤ和AsⅢ两种化合价3-3-3-态，后者是前者的11倍,AsⅤ主要As04与磷酸根（P04）的相似性引起，As04可以竟3-争抑制（P04）在各种机体代谢中起到一定作用，AsⅢ则是与胱氨酸或（-SH）或含-SH的蛋白质紧密结合使其失去原有活性，产生毒性作用。三价砷，尤其是三价砷甲基化后，甲砷酸(MAsⅢ)和二甲基砷酸(DMAsⅢ)，是人体内无机砷（IAS）代谢的产物，现在研究最多的是无机砷，无机砷被认为是人类致癌物，大量文献流行病调查报告结果显示，长期慢性接触砷可以引起皮肤Ca、肝癌、膀胱Ca和肺Ca，砷极大危害人类的健康，我们尽量避免与砷接触。17万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文讨论（3）砷、铝、铅等升高血糖的可能机制砷化合物能损伤胰腺β细胞。无机砷（IAS）通过诱导氧化应激反应成活性氧簇（ROS），[19]激活应激反应通过氧化损伤，正常胰腺β细胞功能失活。LuzM等通过动物实验证实，接触砷化合物的大鼠胰腺存在氧化应激反应。砷可以干扰糖代谢。有学者提出三价砷（AsⅢ）通过抑制葡萄糖代谢中某些酶的功能干扰糖代谢过程。砷化合物干扰胰岛素信号传导[20][21]通路。有研究Simeonova和Styblo等证实，三价砷和被甲基化的砷通过干扰机体细胞[22]内的某些信号传导通路而发挥毒性作用。Kim等研究与糖代谢有关的信号传导时发现，剔除Glut4基因的小树（MG4KO）早期会出现胰岛素抵抗（IR）IRS-1相关的PI-3K的活性下降。总之砷可以导致胰岛素抵抗和外周组织血糖的升高。铅、铝升高血糖的机制：铅、铝含量增高后，结合细胞膜、核酸、钙调蛋白等细胞结[23]构，破坏细胞的正常完整性，进而干扰细胞的功能。结合位于细胞膜上的ATP酶，影响ATP酶的结构，继而抑制其生物活性，对细胞膜发生破坏，掉了了细胞膜内外点电荷平衡[24]++和离子分布，进而损伤机体组织。Na-K-ATP酶参与糖代谢，在主动转运中必不可少，[25]促使糖顺利通过细胞膜，在糖吸收分解过程中起关键作用。糖尿病患者血中糖化蛋白含量较高，其可结合ATP酶并降低其生物活性，抑制葡萄糖的生物转化和红细胞的携氧能力，[26,27]进而导致血糖升高。通过文献报道一致。且铝中毒可导致儿童肥胖，从而发生胰岛素抵抗。本研究对各组糖尿病大鼠进行8周的蓬灰喂养，低、中、高剂量组分别累计灌入砷含量为1.86mg、3.48mg、5.77mg；低、中、高剂量组分别累计灌入铅含量：为7.46mg、13.92mg、23.12mg；低、中、高剂量组分别累计灌入铝含量为9324mg、17416mg、28896mg。实验8周结束时结果发现，糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组糖尿病大鼠血糖明显高于正常对照组（P<0.05）；与正常对照组比较，糖尿病对照组、低、中、高蓬灰组空腹胰岛素水平均有下降趋势（P<0.05）；与糖尿病对照组比较,中、高蓬灰组大鼠胰岛素抵抗指数明显升高（P<0.05）；与正常对照组比较，糖尿病对照组、低、中、高蓬灰组C肽值有下降趋势，（P<0.05）。提示糖尿病大鼠及喂食低、中、高剂量蓬灰的糖尿病大鼠均存在胰岛素分泌不足，胰岛素抵抗加重，并且喂食中、高剂量蓬灰的糖尿病大鼠比没有喂食蓬灰的糖尿病大18万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文讨论鼠的胰岛素抵抗程度明显升高，推测可能蓬灰中含有的砷、铅、生物碱等能加重糖尿病大鼠的胰岛素抵抗，这需要我们进一步研究。3、蓬灰对糖尿病大鼠血清TNF-α水平的影响流行病学的相关文献中表明，炎症可能与胰岛素抵抗有关，最终导致糖尿病的发生[20-21][22]，文献报道中提到胰岛素抵抗的严重程度与炎症因子的数量多少有关。胰岛素抵抗、糖耐量受损、糖尿病的发生、发展与细胞炎性因子的作用直接关联，调整其血浆浓度可以使以上作用减弱。炎症反应导致糖尿病发病的可能机制主要包括：①急性期的炎症介质与脂肪细胞释放的某些可引起IR的产物有关；②细胞因子可使胰岛素信号传导链发生障碍；③致炎症细胞因子可导致脂肪分解，直接促成肝脏合成脂肪酸；④炎症细胞因子可导致内皮功能受到损伤；⑤由于抗炎症细胞因子IL-10的减少，将进一步损伤胰岛素信号传导链与内皮功能；⑥肝脏表达的异常基因增多如：Tains；⑦循环血液中含有强抗炎作用的脂肪结合等。炎性细胞因子最重要有TNF-α,IL-1,IL-6等。TNF-α是天然免疫和特异性免疫的重要介质,又是炎症反应的重要因子。肿瘤坏死因子是一种具有多种生物学功能的细胞因子，它是由骨骼肌细胞、激活的单核巨噬细胞、脂肪细胞分泌而形成的。它通过与细胞膜上的肿瘤坏死因子受体1和肿瘤坏死因子受体2这两种受体相结合，从而发挥多种生物学功能。现研究证实，通过激活中性粒细胞介导内毒素性休克、调节炎症及免疫反应，同时[28]肿瘤坏死因子也是导致胰岛素抵抗发生的重要原因在机体炎症反应和免疫应答中有重要的调节作用，这种细胞因子具有多生物学功能，据研究表明,TNF-α可引起胰岛素抵抗的机制有以下几个方面：1、使胰岛素信号传导通路途径发生障碍：使胰岛素受体酪氨酸激酶的活性受到抑制,使胰岛素受体亚单位相关的酪氨酸残基磷酸化受到阻碍,促进酪氨酸附[29,30]近的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化发生结构异常;与PICKUP等研究一致。2、抑制脂肪细胞中GLUT-4mRNA的表达,降低其对胰岛素的固有的亲和力或减少胰岛素受体的数目的[24]数量，从而引起胰岛素抵抗;与GUPTAA研究一致。3、细胞因子激活途径的负反馈调节物SOCS包括SOCS21、SOCS23、SOCS26,这些都会诱导细胞因子信号传递抑制因子(SOCS)23的表达。4、部分升糖激素如糖皮质激素、肾上腺素水平升高是由TNF–α导致的,同时还会导致降低胰岛素敏感性,参加到胰岛素抵抗中；临床研究也证实,肥胖患19万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文讨论者脂肪组织TNF-α表达水平升高,并随体质量降低,其表达水平下降;阻断TNF-α的[31]信号途径可阻止肥胖诱导的胰岛素抵抗。5、TNF-α还有一些途径可损伤胰岛β细胞[32]导致胰岛素抵抗，直接作用于胰岛β细胞，使其产生cGMP，进一步损伤细胞DNA链导致胰岛素抵抗；通过NF-KB的代谢通路使胰岛β细胞凋亡，导致胰岛素抵抗；促进胰岛内的巨噬细胞分泌IL-1β，从而诱导β细胞产生许多一氧化氮，导致细胞的代谢异常、蛋白的合成障碍、有丝分裂信号异常，即而胰岛β细胞减少，胰岛素抵抗。6、TNF-α对脂蛋白脂酶活性进行干扰，进而加快脂肪细胞内脂肪的分解，导致体内游离脂肪酸水平指数增高，[33，34]胰岛素生物学效应下降。7、TNF-α对与IRS-1关联的PI3K活性进行干扰，使其胰[35]岛素的信号转导发生障碍。8、TNF-α能激发脂肪细胞的分泌，对其它细胞因子发挥生[36，37]物学效应造成影响。影响LEP及IL-6等的表达。本实验对糖尿病大鼠喂养蓬灰8周后结果显示，糖尿病大鼠不论是否喂食蓬灰，血清中肿瘤坏死因子无明显变化（P>0.05），提示蓬灰可能并不通过肿瘤坏死因子（TNF-α）这一种炎性介质影响胰岛素抵抗。在本实验中，糖尿病大鼠的胰腺组织病理检查结果显示（如表5，图1），糖尿病大鼠及喂食低、中、高剂量蓬灰的糖尿病大鼠炎性细胞计数均明显多于正常对照组（P<0.05），并且喂食高剂量蓬灰的糖尿病大鼠胰腺组织中炎性细胞计数显著高于糖尿病对照组(P<0.05)，提示蓬灰可能会引起大鼠胰腺慢性炎症，但是具体会引起何种炎性介质变化有待于进一步研究证实。4、蓬灰对糖尿病大鼠胰腺组织形态学的影响长期的高糖状态将对机体内环境产生“糖毒性”作用，“糖毒性”可导致机体出现一系列病理生理反应。其中胰腺组织是被损害的重要对象之一。当机体处于糖尿病的病理状态下，过多的葡萄糖主要通过多元醇通路和己糖胺通路对蛋白激酶C进行激活，进而形成糖基化终产物，导致血脂异常和氧化应激的发生。氧化应激是由活性氮和活性氧的大量生成引起炎症反应及微循环障碍所致，氧化应激是炎症重要的次级结果，直接引起LDL的氧化修饰、DNA损伤、细胞内蛋白及酶的变性，导致细胞损伤、死亡，最终导致某些疾病的发[38][39]生。各种因素引起的胰腺损伤似乎都首先损伤胰腺间质如腺泡细胞，氧化应激激活胰[39]腺腺泡细胞的胰酶，即胰蛋白酶原转化为有活性的胰蛋白酶，使局部血管产生活性物质20万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文讨论引起血管扩张。OFR及其衍生物能够损伤内皮细胞，使其完整性遭到破坏，血管扩张加重，[40]通透性增加，炎性细胞浸润。进而引起微循环障碍，加重胰腺的损伤。本实验对糖尿病大鼠喂养蓬灰8周后结果显示（见图1），光镜下正常对照组，胰腺小叶整体结构清晰,胰腺小叶内腺泡和导管结构基本正常,没有发现腺泡细胞空泡变性,胰岛外形界限清晰且呈椭圆形或圆形,与腺泡边界清晰，胰岛细胞胞质丰富且未发现变性。糖尿病对照组，低、中、高剂量蓬灰组，胰腺小叶整体结构清晰,胰腺小叶内腺泡和导管结构正常,偶尔发现腺泡细胞空泡变性,胰岛数量减少,体积变小,外形不规则，界限不清晰；胰腺腺泡周围血管扩张充血，周围有炎性细胞浸润，与正常对照组比较，糖尿病对照组、低、中、高剂量蓬灰组大鼠炎性细胞计数均增多，有统计学意义（P<0.05）。随着蓬灰剂量的增加，胰腺腺泡周围血管扩张充血明显，周围有大量炎性细胞浸润。与糖尿病对照组比较，高剂量蓬灰组的胰腺组织中炎性细胞计数高于糖尿病对照组(P<0.05)。提示蓬灰可导致胰腺组织的炎性反应，与“糖毒性”所引起的胰腺损伤相似，加重胰岛素抵抗。5、蓬灰对糖尿病大鼠胰腺、骨骼肌组织胰岛素信号分子表达的影响InsR是一种大分子跨膜糖蛋白，并广泛分布于全身各组织细胞膜，具有典型的变构酶性质。其肽链N端富含半胱氨酸残基的结构域是胰岛素的结合位点。细胞内主要包括酪氨酸（Y）的近膜、C末端、酪氨酸激酶结构域，这三个区域分别与细胞质内胰岛素受体底物-1（IRS-1）结合，在胰岛素胞内信号的传递上发挥重要的作用。胰岛素受体的激活，主要靠以上3个区同时被磷酸化，缺一不可。另外，其还具有ATP结合部位，当发生定向基因突变时，胰岛素受体酪氨酸蛋白激酶活性会丧失。现已发现InsR基因缺陷与严重的胰岛素抵抗和2型糖尿病有关，无论是胰岛素受体数目的减少还是亲和力的降低均可以导致影[41,42]响胰岛素与受体的结合发生障碍从而引起糖尿病的发生。胰岛素受体底物（IRS）是细胞内糖蛋白，属于细胞质中的接头蛋白，是胰岛素受体胞[43]内传导的重要成分，在胰岛素抵抗（IR）中起重要作用，目前研究较多的为IRS-1、IRS-2、IRS-3和IRS-4这4个异构体蛋白，根据所属功能区的不同，发挥的作用和功能[44]亦不同。IRS-1和IRS-2分布广泛，在胰岛信号转导过程中起着主要的作用，对胰岛素和胰岛素样生长因子发挥代谢调节、维持胰岛细胞功能、促进个体正常生长发育等功能21万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文讨论是必需的。IRS-3仅分布于脂肪组织，IRS-4则在垂体、胸腺和脑组织表达。它们则主要作用于胰岛素和IGF-1信号系统并抑制其他IRS蛋白的功能，是一种负性调节因子。IRS-1、IRS-2在糖代谢异常、胰岛素抵抗程度等方面存在组织选择性不同与异质性不同。IRS-1主要存在于骨骼肌,胰腺、脂肪、肝脏等处，在肌肉、脂肪组织摄取并利用葡萄糖方面即胰岛素代谢效应方面起促进作用。IRS-2主要抑制肝葡萄糖输出促进肝脏糖原合成方面起作用。胰岛素受体底物1（IRS-1）IRS-1是首先发现的胰岛素受体的底物，为亲水性蛋白，其广泛分布于胰岛素敏感组织细胞浆内，主要在骨骼肌表达。其质和量的改变可以使其下[45]游分子PI3K的活性改变，在胰岛素信号转导途径中发挥着重要作用当信号转导减弱和受到阻碍时，将会发生胰岛素抵抗。PI3-K活性和含量的改变与胰岛素抵抗密切相关。在[46]高脂高糖高热卡饲料喂养的SD大鼠骨骼肌组织中PI3-K活性明显低于正常对照鼠。根据[47]文献报道，自发性糖尿病大鼠骨骼肌组织内IRS-1蛋白表达与正常对照组比较明显减[48]少，可能是引起2型糖尿病产生IR的分子机制之一。据文献报道在对高脂高糖高热卡饲料喂养的大鼠腹腔注射STZ（低剂量）诱发的糖尿病大鼠的研究中，观察到大鼠肌肉组织中胰岛素受体底物1蛋白的表达量和酪氨酸磷酸化的水平均明显降低。胰岛素底物受体[49,50]1在有丝分裂和代谢反应中都很重要，缺乏胰岛素底物受体1的小鼠出现胰岛素抵抗。大量研究认为当表达降低或IRS-1结构、活性发生异常时，胰岛素在细胞内转导就会受到[51]阻滞IRS-1蛋白水平的高低及结构和功能状态可作为胰岛素信号转导的基础，具有一定地调节胰岛β细胞分泌胰岛素的作用。本研究对糖尿病大鼠喂食蓬灰8周后结果显示，糖尿病大鼠和喂食低、中、高剂量蓬灰的糖尿大鼠的IRS-1表达均比正常大鼠显著减少（P<0.05）；并且在喂食不同剂量蓬灰的糖尿病大鼠中，随着喂食蓬灰剂量的增加胰腺和骨骼肌组织中IRS-1表达水平逐渐下降趋势；高剂量蓬灰的糖尿病大鼠的胰腺和骨骼肌组织中IRS-1表达水平均低于没有喂食蓬灰的糖尿病大鼠(P<0.05，见表6)，而喂食低、中剂量的糖尿病大鼠与没有喂食蓬灰的糖尿病大鼠比较无统计学意义。提示，喂食糖尿病大鼠蓬灰可能会抑制其骨骼肌细胞和胰腺细胞的IRS-1蛋白表达；短期内、小剂量喂食糖尿病大鼠蓬灰可能不会引起明显的胰岛素受22万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文讨论体表达出现明显异常，但是，随着喂食蓬灰的剂量增加，则会显著影响糖尿病大鼠骨骼肌细胞和胰腺细胞的IRS-1蛋白表达，进一步加重胰岛素抵抗。总之，本实验初步探索性的研究了喂食糖尿病大鼠不同剂量的蓬灰8周后对糖代谢的影响，我们观察到：（1）喂食中、高剂量蓬灰的糖尿病大鼠比没有喂食蓬灰的糖尿病大鼠的胰岛素抵抗程度明显升高；（2）喂食蓬灰的糖尿病大鼠胰腺的胰岛数目明显减少,胰岛体积缩小,胰岛外形不规则，界限结构不清,胰腺腺泡周围血管扩张充血明显，周围有大量炎性细胞浸润，且炎性细胞计数显著高于没有喂食蓬灰的糖尿病大鼠；（3）喂食糖尿病大鼠蓬灰可能会抑制其骨骼肌细胞和胰腺细胞的IRS-1蛋白表达。本实验提示，蓬灰可能会引起或加重大鼠胰腺慢性炎症，通过抑制骨骼肌细胞和胰腺细胞的IRS-1蛋白表达，进一步加重糖尿病大鼠胰岛素抵抗的程度，有关机制还有待于我们进一步研究。23万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文结论结论结论1、蓬灰可能会加重糖尿病雄性SD大鼠胰岛素抵抗程度，对血糖无统计学差异。2、蓬灰可引起糖尿病SD大鼠胰腺腺泡组织血管扩张充血，周围炎性细胞浸润，可能会加重糖尿病SD大鼠的慢性低度炎症。3、蓬灰可能会抑制糖尿病大鼠胰腺和骨骼肌组织中IRS-1表达水平，进一步加重胰岛素抵抗程度。24万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文附图附图正常对照组胰腺（HE×100）糖尿病对照组胰腺（HE×100）低剂量蓬灰组胰腺（HE×100）中剂量蓬灰组胰腺（HE×100）高剂量蓬灰组胰腺（HE×100）图1大鼠胰腺HE染色结果25万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文附图正常对照组（免疫组织化学×400）糖尿病对照组（免疫组织化学×400）低剂量蓬灰组（免疫组织化学×400）高剂量蓬灰组（免疫组织化学×400）图2胰腺组织中IRS-1蛋白的表达26万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文附图正常对照组（免疫组织化学×400）糖尿病对照组（免疫组织化学×400）低剂量蓬灰组（免疫组织化学×400）高剂量蓬灰组（免疫组织化学×400）图3骨骼肌组织中IRS-1蛋白的表达27万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文参考文献参考文献[1]ShaoJ,YamashitaH,ete.Phosphatidylinositol3-kinaseredistributionisassociatedwithskeletalmuscleinsulinresietanceingestationaldiabetesmellitus[J].Diabetes,2002,51:19-29[2]ChenL,YaoXH,ete.InvivoinsulinsignalingthroughPI3-kinaseisimpairedinskeletalmuscleofadultratoffspringexposedtoethanolinutero[J].JApplPhysiol,2005,99(2):528-534.[3]刘伟，张凯丽.新疆风味食谱，乌鲁木齐：新疆人民出版社，1983,19[4]谢晓敏，王伟.蓬灰对大鼠胰腺及糖代谢的影响[J].宁夏医学杂志，2012，34（9）：855-856[5]刘英心.中国沙漠植物志，北京：科学出版社，1985，371[6]MakusJT,RobertW.Mechanismsinvolvedinmetalloidtransportandtoleranceacquisition[J].CurrGenet，2001，40(1):2-12[7]RosenBP,CunnarH,BarryP,ete.Biochemistryofarsenicdetoxification[J].FEBSLetters,2002,529(1):86-92[8]DelRazoLM,StybloM,CullenWR,ete.Determinationoftrivalentmethylatedarsenicalinbiologicalmaterices[J].ToxicolApplPharmacol,2001,174（3）：282-293[9]Chin-HsiaoTseng,Ching-Ping，Tseng,ete.Epidemiologicevidenceofdiabetogeniceffectofarsenic[J].ToxicologyLetters,2002,133(1):69-76[10]CHTseng,TYTai,CKChong,ete.Long-termarsenicexposureandincidenceofnon-insulin-dependentdiabetesmellitus:acohortstudyinarseniasis-hyperendemicvillagesinTaiwan[J].EnvironHealthPerspect，2000,108(9):847–851[11]彭忠伯,刘桂元.铝中毒及其防治[J].中华劳动卫生职业病杂志,1993,11(3):186-18828万方数据 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宁夏医科大学硕士学位论文文献综述文献综述胰岛素信号转导障碍与糖尿病胰岛素是人类三大营养物质（糖类、蛋白质、脂类）代谢必不可少的激素之一。作为一种内分泌激素，它由胰岛β细胞分泌经血液循环运输至相应的靶组织、靶器官（主要为肝脏、肌肉及脂肪组织）后，与靶细胞膜上的胰岛素受体（insulinreceptor，InsR）特异性的结合并引发细胞内信号蛋白的级联反应，介导多种生理效应。胰岛素信号转导途径现已知至少有两条：一条是磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide-3kinase，PI-3K）途径；另一条是促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）途径。实验显示，通过抑制MAPK活性而阻断MAPK途径并不降低胰岛素引起的糖转运和[1]糖原合成，而在胰岛素抵抗（insulinresistance，IR）状态，胰岛素刺激引起的PI3-K[2]信号转导途径作用下降，MAPK介导的信号转导作用则正常。这些均说明胰岛素主要通过前一条途径介导其代谢调节作用。众所周知，糖尿病（DiabetesMellitus，DM）是由多种病因引起的，以慢性高血糖为特征的代谢紊乱综合征。糖尿病可分为1型糖尿病（T1DM）、2型糖尿病（T2DM）、妊娠糖尿病和其他特殊类型糖尿病，目前普遍认为，骨骼肌、脂肪和肝脏的胰岛素抵抗和葡萄糖诱导的胰岛β细胞胰岛素分泌功能缺陷是2型糖尿病的发病基础，其中胰岛素抵抗贯穿[3]于2型糖尿病发生、发展的全过程，是2型糖尿病的主要发病机制，同时还是导致糖尿病各种并发症的主要动力根源。胰岛素抵抗是指胰岛素在促进葡萄糖的摄取和利用方面受损，即一定量的胰岛素产生的生物学效应低于预计正常水平的一种状态，主要表现为胰岛素的外周靶组织、靶细胞及其相应的受体对胰岛素的敏感性和反应性降低。由于胰岛素是通过胰岛素信号转导途径发挥其生理作用的，所以胰岛素信号转导障碍是多因素导致胰岛素抵抗、糖尿病的共同重要环节。现就胰岛素代谢效应的主要信号转导途径PI3-K信号转导途径与糖尿病关系作一简要的综述。1胰岛素信号转导途径1.1胰岛素信号转导的步骤胰岛素信号转导可大致分为以下几个步骤：（1）胰岛素到达相应靶组织后，首先与靶33万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述细胞表面胰岛素受体的α亚基结合，激活其β亚基的酪氨酸蛋白激酶（proteintyrosinekinase，PTK）。（2）PTK磷酸化胰岛素受体底物（insulinreceptorsubstrate，IRS）而使之激活，导致受体本身磷酸化和几种底物蛋白磷酸化。（3）InsR底物主要包括不同类型的IRS，IRS作为一种船坞蛋白（dockingprotein），与含肉瘤同源区段2（srchomology2domain，SH2）结构域的信号分子结合，激活三条信号途径：①PI3-K途径；②CAP/Cb1/Tc10途径；③RasMAPK途径。（4）蛋白激酶、磷酸酶级联反应。蛋白激酶（proteinkinase）可使蛋白质底物（酶、信号蛋白）磷酸化，从而使其活化或失活，如酪氨酸蛋白激酶（TK）、丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶。磷酸酶（phosphatase）使蛋白质底物去磷酸化，而将其激活或抑制。（5）生物学效应：刺激葡萄糖转运蛋白-4（glucosetransporter-4，Glut-4）转位，促进细胞葡萄糖摄取；刺激糖原合成酶（glycogensynthase，[4]GS），调节糖原合成等生物学效应；调节细胞生长、增殖及分化。1.2PI3-K信号转导途径胰岛素由胰岛β细胞分泌后经血液循环到达相应的靶器官和靶组织（主要为肝脏、肌肉及脂肪组织），并与其靶细胞膜上的胰岛素受体（InsR）α亚单位相结合，激活其β亚单位的内在激酶活性，导致InsR自身磷酸化。磷酸化的InsR一方面为其它信号分子提供结合位点，另一方面其酪氨酸蛋白激酶的活性可致胰岛素受体底物（IRS）上的酪氨酸被磷酸化。被磷酸化后的IRS暴露出特异性结合位点能募集并激活含有SH2区域的蛋白质激酶即磷脂酰肌醇3激酶（PI3-K），使信号以激酶链式反应下传。活化的PI3-K可使磷脂酰肌醇一磷酸（PIP）或磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）磷酸化成PIP2或磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），随后PIP3激活磷酸肌醇依赖的蛋白激酶（PDK1），后者可使蛋白激酶B（PKB）磷酸化，活化的PDK1或磷酸化的PKB可导致葡萄糖转运蛋白4的合成、分泌、移位等[5,6]变化，产生多种生物学效应，如葡萄糖转运、糖原合成、蛋白质合成等，并调控胰岛素[7,8]分泌，维持胰岛β细胞生长、增殖和存活。2胰岛素信号转导障碍与糖尿病胰岛素信号转导障碍可以发生在胰岛素受体前水平、受体水平及受体后水平三个不同[9,10]的层次，以受体后水平的变化最为多见。（1）胰岛素受体前障碍，如胰岛素基因突变产34万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述生结构和功能异常的胰岛素，胰岛素生物活性下降或丧失；胰岛素抗体形成，干扰胰岛素与其受体的正常结合；胰岛素降解加速；胰岛素的拮抗激素增多等。（2）受体障碍，包括受体结构和功能的异常，受体数目及亲和力降低。（3）受体后障碍，即胰岛素信号转导途径异常，胰岛素信号转导是由多个信号分子参与的级联反应，其中任何一个信号分子表达和（或）活性的改变都可能影响胰岛素信号的转导。2.1胰岛素受体（InsR）与糖尿病2.1.1InsR的结构InsR是一种大分子跨膜糖蛋白，具有典型的变构酶性质，并广泛分布于全身各组织细胞膜。人InsR基因位于19号染色体短臂上，包含22个外显子。1～11号外显子编码α亚基；12～22号外显子编码β亚基，其中17～21号外显子编码TK活性区。两个α亚基与2个β亚基通过二硫键结合形成α2β2异四聚体构成了InsR分子。α亚基分子量为130KD，由723个氨基酸残基组成，肽链N端富含半胱氨酸残基的结构域是胰岛素的结合位点。β亚基为跨膜蛋白，分子量是95KD，是由193个氨基酸残基组成细胞外区域、23个疏水氨基酸形成螺旋组成跨膜区及402个氨基酸组成细胞内区域构成的。细胞内区域具有受胰岛素调节的酪氨酸蛋白激酶活性，其又由含酪氨酸（Y）的三区构成：即近膜结构域(Tyr965，Tyr972)、酪氨酸激酶结构域（Tyr1158，Tyr1162，Tyr1163）及C末端结构域（Tyr1328，Tyr1334）。近膜结构域为InsRβ亚基与胞质内胰岛素受体底物-1（IRS-1）结合所必需，在胰岛素信号的传递上发挥关键作用。当酪氨酸激酶结构域的三个酪氨酸磷酸化部位同时被磷酸化时，胰岛素受体才被激活。另外，其还具有ATP结合部位，其中第1030位赖氨酸残基如定向突变，则胰岛素受体酪氨酸蛋白激酶活性完全丧失。C末端两个酪氨酸磷酸化部位在胰岛素信号传递中的作用尚不明确，可能对受体后信号转导途[11]径起调节作用。也有人研究发现，此结构域与信息传递蛋白Grb-10结合，参与细胞增殖。2.1.2InsR数目和亲和力降低InsR数目在不同的组织差异颇大，且处于不断合成和降解的动态平衡之中，因而其数目也随其周围环境的变化而变化。影响InsR数目的生理、病理或药理的因素很多，诸如运动、膳食、内源性及外源性胰岛素水平、磺酰脲类药物、胰岛素拮抗物等。影响InsR数35万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述目的因素也可以影响受体的亲和力，但无论是受体数目的减少还是亲和力的降低均可以影[12,13]响胰岛素与受体的结合而引起2型糖尿病。2.1.3InsR基因突变和缺失现已发现InsR基因缺陷与严重的胰岛素抵抗和2型糖尿病有关。迄今已发现60余种基因突变，按其结构和功能分为5类：Ⅰ类突变，其结果导致InsR基因表达时mRNA链提前终止，mRNA表达减少；Ⅱ类突变，其结果妨碍InsR蛋白质翻译后加工，妨碍受体分子的正常折叠，受体不能从细胞内的内质网及高尔基体转移到细胞表面，使细胞受体数目减少；Ⅲ类突变，其结果降低InsR与胰岛素结合的亲和力，同时使受体翻译后加工以及受体由内质网及Golgi体向质膜转运发生障碍；Ⅳ类突变，其结果使InsR酪氨酸激酶活性降低；Ⅴ类突变，其结果加速了InsR降解，其机制可能是受体对pH值及温度敏感[14]性降低以及受体与胰岛素解离困难所致。一些研究发现，在InsR基因剔除鼠中，纯合突变鼠（InsR-／-）宫内发育正常，但出生后因极度的胰岛素抵抗，多在1周内死亡；而[15]杂合突变鼠（InsR+／-）表型正常，并无明显的胰岛素信号转导缺陷。肝特异性InsR剔[16]除鼠可致严重的胰岛素抵抗、高胰岛素血症、糖耐量减退及对外源性胰岛素抵抗。专一剔除小鼠胰岛β细胞本身的InsR，而其他组织的此受体完好无损的实验显示，葡萄糖刺激的第一时相胰岛素分泌完全缺失，第二时相略微延迟，但对精氨酸刺激仍有反应，很像2型糖尿病中的β细胞缺陷。近年的研究显示，人胰岛细胞上InsR的表达减少时，葡萄[17]糖刺激的胰岛素基因表达受到抑制。这些均表明胰岛β细胞分泌胰岛素必需有完整的InsR信号转导系统，同时也提示，β细胞水平的胰岛素抵抗也会引起胰岛素分泌下降，因而产生了一种新的观点：用胰岛素抵抗来解释2型糖尿病的发病机制及自然病程。InsR基因突变在胰岛素抵抗中仅占1%，但它可能与下游的一些异常相互影响，参与胰岛素抵抗的形成。除了上述的基因突变所致InsR质与量的异常外，各种调控因素的改变也可导致胰岛素抵抗和2型糖尿病，这些调控因素主要有以下两点：①浆细胞膜糖蛋白-1（plasmacellmembraneglycoprotein-1，PC-1）：PC-1是一种在多种组织广泛表达的穿膜糖蛋白，具有抑制胰岛素信号转导的作用，是胰岛素信号转导的细胞内抑制因子。近年的研究发现，在36万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述胰岛素抵抗患者的成纤维细胞、骨骼肌和脂肪组织中PC-1的表达均增加，且与机体的胰岛素抵抗存在相关性。进一步研究发现，PC-1能直接与InsRα亚基相互作用而抑制其酪氨酸激酶活性以及细胞内信号转导。Betty等观察肝脏及肌肉细胞内PC-1表达被特异性升高的转基因鼠时发现，其空腹及餐后血糖及胰岛素水平均升高，提示PC-1的过度表达[18]可导致胰岛素抵抗和高血糖症。②InsR磷酸化状态的调节：在胰岛素的刺激下，InsR除酪氨酸被磷酸化外，其β亚基上的丝／苏氨酸残基随后也被磷酸化，致使InsR酪氨酸激酶活性下降且使其降解也明显加快，在生理状态表现为一种负反馈调节机制。对InsR磷酸化状态进行调节的因素有三个：一是蛋白酪氨酸磷酸酶（protein-tyrosinephosphatases，PTPase）,包括蛋白酪氨酸磷酸酶-1B（PTP1B）、白细胞抗原相关蛋白酪氨酸磷酸酶（LAR）以及含有SH2区域的蛋白酪氨酸磷酸酶（SHPTP）等。研究表明，胰岛素抵抗患者的胰岛素靶组织中PTP1B和LAR表达增加。进一步的研究显示，PTPase可使[19]InsR酪氨酸脱磷酸化，影响其激酶的激活及胰岛素的信号转导。二是蛋白丝／苏氨酸磷酸脂酶（PP）,包括PP1A、PP2A、PP2B、PP2C等，目前仅知PP2C通过与其相互作用而使其磷酸化的丝／苏氨酸残基去磷酸化，从而对其信号转导起正性调节作用。三是蛋白激酶C（PKC），PKC是一类丝／苏氨酸蛋白激酶，被激活后可使InsR丝／苏氨酸残基磷酸化而降低其激酶活性。胰岛素抵抗常伴随有高胰岛素血症、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）增高、游离脂肪酸（FFA）增高以及高血糖症，它们均能刺激激活PKC，使其活性异常增高，导致InsR激酶活性和信号转导作用减弱。2.2胰岛素受体底物（IRS）与糖尿病2.2.1IRS的结构IRS属于细胞质中的接头蛋白，主要连接InsR和多种效应分子，从而介导细胞对胰岛素的反应，在胰岛素胞内信号转导中占据着中心位置，对维持细胞生长、分裂和代谢过程起重要的作用。IRS-1、IRS-2、IRS-3和IRS-4等至少12个异构体蛋白构成了IRS家族，其中研究较多的为IRS-1、IRS-2、IRS-3和IRS-4，这4个IRS家族成员均具有3个基本功能区，即N端Pleckstin同源结构域（PH区）、磷酸化酪氨酸结合结构域（PTB区）和C端多处磷酸化位点（YXXM／YMXM区）。PH区段的功能是将IRS蛋白定位在细胞37万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述膜紧靠受体处。PH结构域缺失后，胰岛素刺激的酪氨酸磷酸化明显减少，PI3-K活性降低。这说明PH结构域对调节InsR与IRS结合有一定作用，其变异可能影响胰岛素信号传递。PTB区段的功能是作为IRS蛋白与InsR靠膜区NPXY基序的相互作用位点。YXXM／YMXM区变化较大，不具保守性，它的功能是作为多种SH2蛋白的停靠位点。研究表明，IRS-1、IRS-2、IRS-3和IRS-4这4个胰岛素受体底物虽然具有共同的结构特征，但却[20]拥有不同的组织分布和功能。IRS-1和IRS-2分布广泛，在胰岛素信号转导过程中起着主要的作用，对胰岛素和胰岛素样生长因子发挥代谢调节、维持胰岛细胞功能、促进个体正常生长发育等功能是必需的。IRS-3和IRS-4分子量分别为60KD和160KD，IRS-3含有较少的磷酸化位点，仅分布于脂肪组织，IRS-4则在垂体、胸腺和脑组织表达。它们则作为一种负性调节因子作用于胰岛素和IGF-1信号系统并抑制其他IRS蛋白的功能，可能起着相对富余的作用。IRS-1和IRS-2在胰岛素信号转导中的作用既相似又有所差别。去[15,21]基因小鼠的研究发现：IRS-1去基因小鼠PI3-K活性降低，IRS-2表达及其磷酸化代偿性增加，而且伴有糖耐量的异常，肌、脂肪细胞胰岛素抵抗及对胰岛素样生长因子-1的抵抗而致生长停止；IRS-2去基因小鼠则出现中重度胰岛素抵抗，伴有早期β细胞功能衰竭，并出现糖尿病。由此可见，IRS-1、2去基因小鼠均虽呈现糖代谢异常及胰岛素抵抗，但两者程度不同，且有明显的组织选择性与异质性。二者比较，在胰岛素代谢效应方面即促进肌肉、脂肪组织摄取利用葡萄糖，以IRS-1为主；而在促进肝脏糖原合成和抑制肝葡萄糖输出方面，则以IRS-2为主；两者同时作为调节β细胞功能的重要信号分子，IRS-1[22]主要调节胰岛素分泌过程，IRS-2则主要调节β细胞增殖、生长、存活。2.2.2IRS-1IRS-1是首先发现的胰岛素受体的底物，为亲水性蛋白，分布较广泛。在胰岛素作用的所有外周组织如骨骼肌、脂肪、肝脏等均有分布，但主要在骨骼肌表达，所以IRS-1-/-所致的胰岛素抵抗主要为外周抵抗。在胰岛素抵抗和2型糖尿病患者及动物模型的体内和体外实验研究中均观察到了IRS-1、IRS-2基因及蛋白表达水平的改变。国内叶华的研究显示，2型糖尿病患者及其一级亲属不管其是否伴有糖耐量损害，均存在骨骼肌胰岛素抵抗，虽然骨骼肌中IRS-1的表达减少并无统计学意义，但胰岛素刺激后IRS-1酪氨酸磷38万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述[23][24]酸化作用明显受损。李松林等的研究发现，自发性糖尿病大鼠骨骼肌组织内IRS-1蛋白表达较正常对照组明显减少，而SH-PTP2蛋白表达则较正常对照组增加，提示IRS-1及SH-PTP2蛋白表达的异常改变，可能是引起2型糖尿病产生胰岛素抵抗的分子机制之一。[25]李春蕊等在对高热量饮食加低剂量STZ诱导的2型糖尿病大鼠的研究中，也观察到了实验性2型糖尿病大鼠骨骼肌组织中IRS-1蛋白表达量及酪氨酸磷酸化水平的明显降[26]低。Renstrom等采用RT-PCR及蛋白免疫印迹技术观察了高浓度胰岛素和葡萄糖孵育下的脂肪细胞内IRS-1、IRS-2基因及蛋白表达水平的变化，得出了2型糖尿病脂肪细胞内IRS-1、IRS-2蛋白表达的下降是胰岛素抵抗和高胰岛素血症的结果，而不是其原因以及高浓度胰岛素和葡萄糖环境下IRS-1、IRS-2蛋白表达的减少是由翻译后及基因表达水平的抑制两种不同的机制所致的结论。流行病学研究提示，适量的饮酒与胰岛素敏感性增强和2型糖尿病发病危险降低有关，而长期过量饮酒与胰岛素抵抗和2型糖尿病发病危险增加有[27]关。张旭照等研究发现，适量饮酒可以升高骨骼肌的IRS-1mRNA表达水平，而长期过量饮酒可以降低其IRS-1mRNA表达水平，在一定程度上引起胰岛素抵抗，提示饮酒与2型糖尿病的关系可能是通过骨骼肌胰岛素信号转导通路中IRS-1mRNA的改变而实现的。Aspinwall等剔除小鼠β细胞IRS-1后发现，胰岛素刺激的细胞内钙离子浓度变化和胰岛素分泌均消失，而高表达IRS-1的β细胞瘤细胞中，胞内钙离子浓度增加，胰岛素分泌也增加。进一步的研究表明加入PI3-K抑制剂可阻断IRS-1增加β细胞内钙离子浓度、刺激胰岛素分泌的作用，说明IRS-1主要通过PI3-K激活途径发挥作用，是β细[22]胞胰岛素分泌的重要信号。作为调节胰岛β细胞功能的重要信号分子IRS-1在整个胰岛上广泛分布，它调节胰岛素分泌的机制为：通过抑制内质网上钙离子ATP酶，使细胞内[28]钙离子浓度升高，从而激活蛋白激酶C，刺激胰岛素释放。Kulkarni等研究显示，IRS-1调节胰岛素分泌与钙离子信号及胰岛细胞上SERCA-2b和3基因表达有关。2.2.3IRS-2IRS-2是一种分子量为190KD的蛋白质，分布也较广泛，但主要在肝脏和胰腺β细胞中大量表达。在肝脏的胰岛素信号转导和胰腺的发育中起着关键的作用，其缺陷所诱发胰岛素抵抗的主要发生部位是肝脏。虽然IRS-1主要作用于骨骼肌，但IRS-2同时也参39万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述与了骨骼肌的胰岛素信号转导。对于IRS-1-／-和野生型大鼠，骨骼肌中胰岛素刺激的葡萄糖转运在节食诱导下都增加，节食处理后的野生型大鼠骨骼肌中IRS-1表达下降，但IRS-2表达不变；同时发现IRS-1-／-大鼠骨骼肌中IRS-2的表达比野生型大鼠的高。这说明对于节食诱导的大鼠骨骼肌中葡萄糖转运的增加IRS-2是主要的，而不是IRS-1，而且IRS-1的缺陷会引起IRS-2的代偿性增加。患妊娠糖尿病的肥胖妇女的骨骼肌中IRS-1蛋白含量和磷酸化水平都下降近50%，葡萄糖转运活性降低，但IRS-2蛋白含量升高了1.5-2倍，因此妊娠期胰岛素抵抗主要与IRS-1的降低有关，而此时IRS-2的升高[29]无法代偿。在2型糖尿病患者脂肪组织内IRS-1的蛋白表达减少时，IRS-2的蛋白表[30]达无改变；高糖培养3T3-L1脂肪细胞，在其葡萄糖转运受到明显抑制的同时，IRS-2的[31][32]蛋白表达以一种剂量依赖的方式出现明显的上调。实验研究显示，在采用低剂量链脲佐菌素尾静脉注射联合高脂饲料喂养建立2型糖尿病大鼠模型中其肝脏IRS-2mRNA和蛋白表达较正常对照大鼠均明显减少，提示肝脏IRS-2的减少可能是2型糖尿病和胰岛素抵抗的发病机制之一，而罗格列酮能使糖尿病模型大鼠肝脏IRS-2mRNA和蛋白表达增加，这可能是其改善胰岛素抵抗的作用机制。IRS-2作为维护胰岛β细胞功能的关键信号蛋白，主要分布在胰岛的外周。它调控胰岛β细胞生长、存活和有丝分裂的功能主要是通[33]过PI3-K和MAPK两条通路来完成的。Kubota等特异性敲除小鼠胰岛及下丘脑的IRS-2基因后发现，葡萄糖诱导的胰岛素分泌受损，胰岛β细胞数量及增殖也明显减少，[34]并出现糖耐量异常。Rhodes的研究发现，IRS-2在肝组织和一些胰岛素靶组织中抑制胰岛素抵抗的发生，而且对提高β细胞生长和生存也非常重要，同时IRS-2对胰岛β细胞数量和胰岛素抵抗之间的平衡也是一个关键的参与者。而近年进行的大量相关研究也证[35]实，提高IRS-2在胰岛β细胞的表达，能合理的治疗胰岛β细胞不足和糖尿病。相反，IRS-2缺乏可引起胰岛素信号转导途径的障碍从而使胰岛β细胞的数量不足，胰岛[36]素分泌障碍。2.3磷脂酰肌醇-3激酶（PI3-K）与糖尿病2.3.1PI3-K的结构PI3-K是处于IRS后的信号分子，是胰岛素信号向调节糖代谢方面传递的关键蛋白。40万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述PI3-K有4种亚型，即PI3-K1A、1B、2、3，但只有PI3-K1A在胰岛素信号转导中起作[37]用。PI3-K是由P85亚基和具有酶活性的P110亚基构成的异源二聚体，其中P85为调节亚基，相对分子质量为85000，它含有2个SH2结构域及1个SH3结构域，SH2结构域位于C末端，能与含磷酸酪氨酸残基的信号分子如IRS-1结合，SH3结构域位于P85亚基的N末端，能与富含脯氨酸的各种信号蛋白结合，其C端和N端之间的非编码区与P110亚基结合。P110则为催化亚基，相对分子质量为110000。静息状态时，P85对P110起抑制作用，在胰岛素刺激下，P85通过SH2结构域与IRS相结合，当2个SH2结构域均被磷酸化的YMXM占领时，其抑制作用解除，P110被激活且活性达到最大。继而活化的P110一方面催化一系列磷酸肌醇磷酸化，产生PIP2和PIP3。PIP3被认为是胰岛素和其他生长因子的第二信使，它与蛋白激酶B（PKB）和3-磷酸肌醇依赖的蛋白激酶（PKD）结合，浆膜上PKB和PKD的同域化，使得PDK可以促进PKB苏氨酸308发生磷酸化，加速了Glut4和Glut1向膜的转运，调节肌细胞、脂肪细胞和肝细胞对葡萄糖[38]的摄取；另一方面，通过抑制烯醇式丙酮酸羧基酶而抑制糖异生，最终产生多种生物学效应，如糖原合成、蛋白质合成、葡萄糖转运、抗脂肪分解和抑制细胞凋亡。在培养细胞系和离体肌肉组织中，PI3-K抑制剂可完全抑制胰岛素刺激的Glut4的转运，降低葡萄糖的摄取，从而证实PI3-K是胰岛素刺激的葡萄糖转运和摄取的重要信号分子。2.3.2PI3-K活性和含量的改变现代医学认为，胰岛素抵抗贯穿于2型糖尿病发生、发展的全过程，故凡能影响胰岛素抵抗的各种因素在2型糖尿病的发生发展中都起着不可忽视的作用。目前已证实，PI3-K是胰岛素刺激葡萄糖摄取和葡萄糖转运蛋白4转位所必需的信号分子，PI3-K活性和含量的改变与胰岛素抵抗密切相关。在高脂饮食喂养的SD大鼠骨骼肌组织中PI3-K活性明显低[39]于正常对照鼠。胰岛素抵抗的OLETF鼠中，胰岛素激活PI3-K的效应也明显存在缺陷[40][41]。周云枫等在对高脂高糖饮食加小剂量链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠的实验研究[42]中发现其肾组织中PI3-K的含量也较正常对照组明显减少。Wu等的研究也发现，胰岛素抵抗、2型糖尿病大鼠的大动脉PI3KmRNA表达显著降低。有研究显示，骨骼肌细胞内[43]PI3K的调节亚基P85缺陷小鼠出现糖耐量异常及肌细胞胰岛素抵抗。人群研究发现41万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述[44,45]，在2型糖尿病患者及伴有糖耐量异常的肥胖患者体内均存在胰岛素刺激下的PI3K[46]活性的降低。Andreeli等研究2型糖尿病患者、单纯肥胖者及健康人的骨骼肌和脂肪组织中InsR、IRS-1和PI3-K的mRNA表达发现，在胰岛素刺激下，单纯肥胖者及健康人的PI3-KmRNA表达明显增加，而2型糖尿病患者的PI3-KmRNA的表达则无明显改变，说明在2型糖尿病患者中存在胰岛素调节的PI3-K基因表达缺陷。以上证据均说明胰岛素抵抗时，胰岛素靶细胞中PI3-K的含量和活性降低并存在对胰岛素刺激的敏感性缺陷。2.3.3PI3-K基因变异2型糖尿病患者PI3-K含量和活性的异常可能是多方面因素作用的结果，其中PI3-K[47]及其相关物质的基因变异被认为是主要因素。有研究表明，PI3-K基因尤其是膜靶向性PI3-K的过度表达可使IRS-1和IRS-2的丝氨酸／苏氨酸残基磷酸化，导致两者降解增加，进而产生胰岛素抵抗，另外，许多与PI3-K相关的物质基因缺陷也可影响PI3-K的活性和功能，如IRS-1第972位Gly-Arg突变，体外表达该突变的细胞呈PI3-K活性减少20-30%，同时IRS-1与PI3-K结合也减少。2.4葡萄糖转运蛋白4（Glut4）与糖尿病2.4.1Glut的结构至今在哺乳动物细胞中发现了6种Glut，编码这类蛋白的基因被命名为GLUT1-5和GLUT7，GLUT6是一个不能表达蛋白的假基因。人类的Glut家族氨基酸数量从492-524个不等，其氨基酸序列有一定保守性。从二级结构看，Glut多肽骨架共有12个跨膜区域，6个胞外环和5个胞内环，氨基端和羧基端均位于胞浆侧。跨膜区域序列和胞内的短环序列为保守序列，担负着Glut参与葡萄糖转运的共同功能。GLUT基因定位较分散，GLUT1和GLUT5定位于1号染色体短臂的不同区域，而GLUT2，3，4分别定位于3号，12号和17号染色体。Glut家族中，Glut4在葡萄糖吸收和利用中的作用尤为的重要。Glut4是一种分子量约45-55KD的糖蛋白，仅表达于胰岛素敏感的肌肉细胞（如骨骼肌和心肌）和脂肪细胞（如白色脂肪和褐色脂肪），褐色脂肪中Glut4含量最高，其次是心肌、红肌、白肌和白色脂肪。它对胰岛素反应敏感而迅速，并快速增加葡萄糖的转运，在葡萄糖的吸收和利用上起了关键限速作用。在基础状态下，血胰岛素处于低水平，绝大部分Glut4位于胞42万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述浆内，此时葡萄糖转运吸收减少；进餐后，血糖升高，血胰岛素释放增加，分别作用于脂肪细胞和肌肉细胞的InsR，通过PI3-K途径，致使Glut4合成、分泌、移位，最终促进细胞对葡萄糖的摄取和利用增加，降低了血糖水平。正常人葡萄糖钳夹实验发现，肌肉[48]Glut4水平和全身葡萄糖利用率存在直接相关。Lee等通过实验证实长期运动锻炼可使[49]大鼠骨骼肌中Glut4蛋白和mRNA的表达升高，胰岛素的敏感性增加。还有研究显示，饮酒是引发糖尿病的环境因素之一，长期过量的摄入可使胰岛β细胞的数量减少，并通过降低骨骼肌细胞PI3K的激活和减少Glut4mRNA的表达导致胰岛素抵抗。2.4.2Glut4和葡萄糖转运调节途径障碍目前认为Glut4和葡萄糖转运调节包括几种信号转导途径，这几种途径在一系列囊泡转运过程中重叠在一起。一条是P13K介导的丝氨酸/苏氨酸激酶（PKB）和非典型蛋白激[50,51]酶C（PKCζ/λ）信号通路；另一条是非P13K依赖的包含c-Cb1和c-Cb1关联的[52]CAP二聚复合物信号通路。有学者提出了SNARE假说，v-SNAREs(在运输小囊泡中发现的膜蛋白)以高度特异的方式与t-SNAREs(在相关目标膜上发现的膜蛋白)结合,使运输囊泡向目标膜靠近，最后融合完成GLUT4转位，而在Zucker肥胖大鼠骨骼肌中v-SNAREs和[53]t-SNAREs蛋白水平升高，并与胰岛素抵抗有关。2.4.3Glut4转位受损[54,55]研究显示，高脂喂养大鼠、2型糖尿病大鼠以及Zucker肥胖大鼠骨骼肌中均存在胰岛素诱导的GLUT4从细胞内膜转位至细胞外膜损害，骨骼肌葡萄糖转运受损导致整个机体葡萄糖摄取受损是2型糖尿病的发病机制。3结语胰岛素信号转导途径错综复杂，其中包含多个蛋白激酶和癌基因表达蛋白的相互作用，而许多具体的作用机制尚未弄清。目前较为公认的看法是：PI3K-PKB信号转导途径是胰岛素调节糖代谢效应的主要信号转导途径，其信号途径中的任意一个信号分子表达和（或）活性降低都可能导致糖尿病的发生。现今，还需进一步的研究，明确具体的糖尿病信号转导障碍的机制，使人们对糖尿病的发病机制有更为系统、深入的认识，也为糖尿病的防治提供新思路。43万方数据 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宁夏医科大学硕士学位论文致谢致谢本课题是在导师谢晓敏教授悉心指导下完成的。衷心感谢导师在三年学习期间对我在学业上的严格要求和精心教导；生活上的悉心关怀和热心帮助，使我的学业得以顺利完成。衷心感谢宁夏医科大学分子生物学实验室王洁老师，实验动物中心杨卫东老师，宁夏医科大学第二附属医院病理科张少华老师以及一起参加实验的同学，感谢他们在我实验期间给予的指导与帮助。感谢银川市第一人民医院内分泌科老师在我下临床期间给予的支持与帮助，使我受益匪浅。衷心感谢我的家人对我工作和是的帮助和支持，是他们为我提供了坚强的后盾，使我能顺利完成学业。50万方数据 宁夏医科大学硕士学位论文攻读学位期间发表的学术论文攻读学位期间发表的学术论文1、强丹,白云贤,牛旭东.空腹血糖及血脂与胰岛素抵抗关系的研究[J].宁夏医科大学学报，2013,35（11）：1231-12332、赵瑞，强丹，谢晓敏.蓬灰对2型糖尿病大鼠胰腺及骨骼肌IRS-1蛋白表达的影响[J].天津医药，2013,41（8）：291-29451万方数据 个人简历一般情况：姓名：强丹性别：女年龄：32民族：回族籍贯：宁夏银川学习、进修与工作经历：2000年-2005年宁夏医科大学临床学院本科2010年-2013年宁夏医科大学研究生52万方数据