增液汤对津亏衰老便秘大鼠肠道菌群及宿主代谢影响研究

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1、广东药科大学硕士研究生学位论文分类号：___________密级：__________UDC：___________增液汤对津亏衰老便秘大鼠肠道菌群及宿主代谢影响研究姓名：刘德亮学号：2111540045院系：药学院学位类型：学术学位专业：药物分析学研究方向：现代仪器分析技术在药物分析中的应用导师：毋福海教授论文提交日期：2018.3.20论文答辩日期：2018.5.17学位授予单位：广东药科大学二〇一八年五月广东药科大学硕士研究生学位论文StudyOnTheEffectOfZengyeDecoctionOnIntestinalFloraAndHo

2、stMetabolismInAgedConstipationRatsWithFluid-DeficiencyCandidate：LiuDeliangStudentID：2111540045Affiliation：SchoolofPharmacyAcademicDegreeApliedfor：MasterofMedicineSpeciality：PharmaceuticalAnalysisSupervisor：Prof.WuFuhaiDayofDefence：May2018Degree-Conferring-Institution：Guangdong

3、PharmaceuticalUniversityMay2018广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学硕士研究生学位论文增液汤对津亏衰老便秘大鼠肠道菌群及宿主代谢影响研究摘要目的：增液汤作为我国的传统古方，目前在临床上广泛用于治疗津亏便秘以及其它慢性疾病。但是大多数关于增液汤的研究都是基于它的药理作用，仍然缺乏一种综合的、系统的研究去进一步揭示其发挥治疗效果的特定的作用途径或潜在的作用靶点。近些年来，人们开始意识到肠道菌群与肠道生理功能的关系，这提示了我们，增液汤发挥治疗作用的靶点也许与肠道菌群相关。因此，本论文从分子生物学、肠道微生态学和代谢组

4、学的角度探究增液汤治疗便秘的靶点，更深入地阐明增液汤药效的本质，解释肠道微生态群落与宿主代谢组在便秘的发病机制以及增液汤的治疗过程中的作用。方法：①采用限水法叠加灌胃盐酸洛哌丁胺和皮下注射D-半乳糖的方法建立津亏便秘衰老模型。并通过宏观指标：体重、24小时排便量和进食量；生化指标：SOD值（超氧化物歧化酶）和MDA值（丙二醛）；生理指标：小肠墨汁推进率、小肠含水率、结肠粘膜厚度、皮肤真皮层厚度；病理切片：结肠粘膜细胞状态、皮肤真皮层细胞状态，来评价造模效果。并在模型成功之后给予增液汤治疗，用上述指标来评价治疗效果。②在动物实验期间于不同时间点收集大

5、鼠的粪便和尿样。其中，部分粪样被用来进行生物信息学分析，包括DGGE（变性梯度凝胶电泳）和16SRNA测序。另外一部分粪样和尿样则送去打核磁进行代谢组学分析。在分析代谢物时，我们先对核磁谱的峰进行归属。然后对所得积分数据进行多元统计分析，筛选与模型以及给药相关的差异代谢物，通过代谢通路分析，找到影响的生物相关代谢通路。解释对宿主代谢的调控作用。在肠道微生态学分析中，我们先利用PCR-DGGE（聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术）研究津亏衰老便秘大鼠以及增液汤干预后的肠道菌群指纹图谱，并探讨肠道菌群随时间变化趋势。再利用16SrDNA测序技术分析肠

6、道菌群的结构与多样性。最后通过LEfSe分析和PICRUSt分析筛选津亏衰老便秘证模型大鼠肠道菌群生物标志物并预测其功能，最后利用宏基因测序去验证代谢功能。结果：①在造模结束后，模型组大鼠出现体重下降，食欲不振，排便量减少的情况，在解剖后我们发现模型组的大鼠小肠墨汁推进率、小肠含水率、结肠粘膜厚度和皮肤真皮层厚度均明显低于正常组，并且模型组大鼠的SOD值显著低于正常组而·i·广东药科大学硕士研究生学位论文MDA值显著高于正常组。在药物干预后，上述指标均有不同程度的改善。②代谢组学结果显示：选取造模结束即第28天的数据进行解谱，共解出了105种内源性

7、代谢物，其中尿样代谢物74个，粪样代谢物56个。经过多元统计学分析，我们进行模型验证，验证方法为排列验证（permutationtest）和CV-ANOVA。实验证明造模第28天时，所有的模型参数均符合要求且和验证均通过。同样的，借助多变量统计分析方法，我们找出了尿样和粪样中的差异代谢物。其中尿样27个，粪样23个。在代谢通路分析中，我们发现造模后对宿主的影响，分别是：干扰了能量代谢；抑制了丁酸的合成；干扰了胆碱和甲烷的生物活性；扰乱了肝肾功能；干扰了体内氨基酸的代谢。在给予药物治疗后，药物干预导致了模型组中20个代谢物发生显著变化（尿样12，粪样

8、9，共同1）。且这些代谢物的变化趋势与造模时期相反，影响的代谢通路主要为能量代谢，甲烷代谢，氨基酸代谢和细菌毒素代谢。③肠