dna分子标记及其在冬虫夏草研究中的应用

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1、食用菌学报2002.9(3):52～56ActaEdulisFungi文章编号:1005-9873(2002)03-52-05DNA分子标记及其在冬虫夏草研究中的应用宋敦伦张军陈建新(中国农业大学昆虫系,北京100094)摘要:概述了DNA分子标记技术的发展过程、种类、基本原理和特点,并介绍了其在冬虫夏草研究领域中的应用和前景。关键词:DNA;分子标记;冬虫夏草中图分类号:S567.35;Q943.2文献标识码:A随着分子生物学技术的迅速发展,在生物学领域诞生了直接从DNA水平上进行遗传分析的分子标记

2、技术。进入90年代以来,DNA分子标记在冬虫夏草研究中也得到了广泛的应用。DNA分子标记(DNAmolecularmarker)是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记,它可以反映生物个体或种群基因组的差异,而这种差异可以通过将基因组DNA经限制性内切酶酶切、PCR扩增、分子杂交等技术在凝胶电泳上检测出来。与传统的形态学标记和同工酶标记相比,DNA分子标记具有以下几个优点:①直接以DNA为表现形式,不受生物的生长条件和发育阶段的影响,在生物的任何生长阶段都可以检测;②由于基因组DNA的变异极

3、其丰富,分子标记的数量几乎是无限的;③检测手段简单、迅速。自从1980年人们认识到生物个体间DNA序列的差异可被用作遗传标记以来,DNA分子标记技术便得到了迅猛的发展,相继有数十种DNA分子标记技术问世。1DNA分子标记的种类1.1限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)[1]RFLP出现最早,也称为第一代DNA分子标记,是由BosteinD首先提出的基于South2ern杂交技术的一种分子标记,其原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后

4、形成的特定大小的DNA片段。由于不同来源DNA的特定的限制性内切酶酶切位点分布不同,每一种DNA与限制性内切酶酶切所产生的片段大小都是特异的,从而产生了多态性。RFLP技术的基本步骤是:先将供试基因组DNA酶切,通过琼脂糖凝胶电泳分离得到片段,在原位进行变性后转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,再用经放射性标记的DNA或RNA与固定于滤膜上的DNA杂交,最后通过放射性自显影确定与探针互补的电泳谱带位置,从而确定同源片段的大小。对于分子量较小的DNA样本,也可以在酶切后对其产物直接进行电泳分析,得到DNA的

5、RFLP图谱。RFLP标记非常稳定,在所有生物中的检测程序一致,标记数量较大。可以用RFLP来收稿日期:2002-04-26原稿;2002-05-28修改稿3期宋敦伦等:DNA分子标记及其在冬虫夏草研究中的应用53构建遗传图谱,但是采用Southern杂交技术的RFLP操作较复杂,成本高,检测中要用放射性同位素,限制了它在实际操作中的应用。1.2以PCR为基础的分子标记随着聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术的发展,诞生了许多在PCR基础上改进的第二代分子标记技

6、术。1.2.1随机扩增多态性DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)RAPD是90年[2]代初由WilliamsJGK和WelsonJ分别独立发展起来的一项新的分子标记技术,与RFLP一样,RAPD也是以检测DNA的多态性为目的,但RAPD是通过聚合酶链式反应特异扩增DNA片段的多态性。通常采用多个具有10bp左右的寡聚核苷酸作随机引物,通过PCR反应产生不连续的DNA产物,由于不同基因组DNA序列存在差异,其与随机引物的结合位点不同,扩增产物的数量、大小就不同,

7、因而可通过凝胶电泳观察DNA多态性。RAPD简便迅速,不需要放射性同位素、Southern印迹等繁琐程序,且样品需要量少,灵敏度高,缺点是RAPD对模板2+浓度、Mg浓度等反应条件相当敏感,所以试验的重复性较差。1.2.2简单重复序列(SimpleSequenceRepeat,SSR)的多态性SSR是利用真核生物基因组[4]中存在的大量重复序列(微卫星序列)设计引物,扩增串联的重复序列,依据微卫星寡核苷[5]酸的重复次数在同一物种不同基因型间的差异,揭示长度多态性。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳可提高其分辨率

8、,可检测出单拷贝的差异,其检测快速、信息量大,但成本高,工作量较大,目前SSR标记已在主要的农作物研究中得到应用。1.2.3扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP)AFLP是[6]1992年由荷兰ZabeauM和VosP在PCR和RFLP的基础上发展起来的新一代分子标记技术,它结合了RFLP和RAPD技术的优点,具有分辨率高、效率高和稳定性好的优点。AFLP的原理是:先利用限制性内切酶水解基因