鹅源粪肠球菌efaa基因的克隆表达和生物信息学分析

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1、分类号——ICS——学校代码学号10136荽}差。土莩一3复内蒙右民苁大学硕士学—≥T▲义鹅源粪肠球菌efaA基因的克隆表达和生物信息学分析CloningandExpressionaswellasBioinformaticsAnalysisofefaAGeneofEnterococcusFaecalisfromGoose申请人：曾钰然学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病的分子流行病学和防制新方法研究学位类别：学术学位指导教师：高原教授论文提交日期：二。一三年五月摘要目的：构建鹅源粪肠球菌efaA基因的原核表达载体，在大

2、肠球菌工程菌BL21中表达，对所表达的efaA蛋白进行免疫原性检测及生物信息学分析。方法：提取粪肠球菌标准株与分离株的总DNA，做扩增模板：登陆Gerd3ank，根据其公布的粪肠球菌心内膜炎抗原的碱基序列，应用PrimerPremier5．0与Oligo6．0软件设计一对efaA的特异性引物；摸索PCR扩增条件扩增成功后，进行凝胶电泳分离并回收目的片段；将该片段与pMDl8．T克隆载体连接，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞；筛选阳性克隆菌，提取质粒，进行PCR和单双酶切鉴定，确证克隆成功后送公司测序。酶切克隆成功的pMDl

3、8．T．efaA重组质粒。构建pET-28a-efaA重组质粒并将其转至大肠杆菌BL21感受态细胞中；筛选pET-28a-efaA／BL21阳性菌株，分别在不同浓度、时间及温度条件下诱导表达，确定最佳诱导条件；通过蛋白电泳SDS．PAGE鉴定确证后，用镍柱纯化，得到纯化的efaA蛋白。用SDS．PAGE和Westernblot两种方法鉴定efaA蛋白。对表达的efaA氨基酸序列进行生物信息学分析：根据对efaA氨基酸组分、分子质量、滴定曲线与等电点等分析，预测其一级结构中糖基化位点等，根据对其可塑性、亲水性、抗原性指数和表

4、面可及性以及B．转角、无规则卷曲等的综合分析，预测潜在抗原表位。结果：成功克隆了鹅源粪肠球菌菌株心内膜炎抗原efaA基因，其碱基序列为726bp，编码242个氨基酸。成功构建了pET-28a-efaA／BL21表达载体，确定最佳诱导条件为，IPTG终浓度1．Ommol／L、温度28℃、时间4h，所表达的蛋白为30KD，大小与预期一致。SDS—PAGE和Westernblm鉴定，ef狐蛋白为30KD，与预期一致。鹅源粪肠球菌e姒蛋白的第13～19、26----33、66--一73、92～105、141～149、152～164

5、、190,-一200、210"～260位氨基酸，其亲水性指数>0、AI>／0、表面可及性>1，具有13．折叠和无规则卷曲，是efaA蛋白的B细胞潜在抗原表位。结论：成功克隆了鹅源粪肠球菌efaA基因，表达了efaA蛋白，确定了表达最佳条件，综合预测了efaA蛋白的B细胞潜在抗原表位。关键词：粪肠球菌；鹅；efaA基因；克隆；efaA蛋白：原核表达；生物信息学分析CloningandExpressionaswellasBioinformaticsAnalysisofefaAGeneofEnterococcusFaecalis

6、fromGooseAbstractObjective：ToconstructtheprokaryoticexpressionvectorofefaAgeneofEnterococcusfaecalisfromgooseandexpressedinE．coliBL21whichistheengineeringbacteria．DetectedtheimmunogenicityandbioinformaticsanalysisofefaAprotein。Method：ToextractthewholeDNAfromthesta

7、ndardstrainandtheisolatesastheamplificationtemolet；AccordingtothebasesequenceofendocarditisantigenofEnterococcusfaecalispublishedinGenBank，usedPrimerPremier5andOli906softwaretodesignacoupleofspecificprimersofefaA；ItissuccessfuHyforamplificatingtheconditionsofPCR，a

8、garosegelelectrophoresisareisolated．Isolatedandrecycledthefragrnent；JunctedthefragmentandpMD18-TcloningvectorthentransformedintoE．coliDH5ctcompetencecel