mgitrl增强ev71-vp1基因疫苗免疫应答的实验研究

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1、分类号UDCR392．1l612密级公Ⅱ编号1Q29窆Z!Q!垒Q13◎江艨．大擎硕士学位论文MASTER，SDISSERTATIoN论文题目塑鱼!!丛擅翌星y21：y里!基国瘗苴鱼瘗廑筌的塞验盟宜论文答辩H期2Q!三生鱼目墨日2013年6月分类号区3里2：!!UDC612硕士学位论文密级公珏鸟南号!Q22坌Z!Q!垒Qi三mGITRL增强EV71．VPI基因疫苗免疫应答的实验研究THEEFFECTSoFMGITRLASMoLECULARADJUVANToNIMMUNERESPoNSESAGAINSTHFMD

2、BYDNAVACCINATIoN作者姓名：袁靖指导教师：王胜军教授小组成员：许化溪教授申请学位：硕士学科专业：临床检验诊断学论文答辩日期：2013年6月8日学位授予单位：江苏大学学位授予日期：2013年6月17日答辩委员会主席：吕力为教授评阅入：独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下独立完成的，除文中注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体的研究成果。对本论文做出重要贡献的个人和集体，均在文中作了声明并表示谢意。作者签名：轰嘈日期：joI；年‘月】o日学位论文版权授予书本学位论

3、文作者同意学校保留该学位论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。学位论文作者签名：袁咱签字日期：)oI专年‘月】D日导师签名：Zll≥辫辩醐∥“月J17江苏大学硕士学位论文摘要背景：肠道病毒7l型(EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属，是引起手足口病的主要病原体。EV71于1969年首次分离得到，己在世界范围内引起多次爆发和流行。感染EV71后

4、可引起多种疾病，如手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹、脑炎等多种神经系统并发症。HFMD的广泛流行已经成为重大的公共卫生问题，因此研制安全有效的疫苗成为控制HFMD流行的首要措施．目前已有多种措施来提高DNA疫苗的免疫效果，如能有效改善DNA疫苗免疫应答的佐剂，包括各种细胞因子、黏附因子、蛋白因子、化学分子、脂质体等。以前的研究发现GITRL能够诱导特异性免疫应答，因此我们考虑将GITRL作为免疫佐剂来构建一种新的DNA疫苗。方法：(1)采用PCR的方法扩增EV71外壳蛋白VP!和mGIT

5、RL基因，连接至PMD．18T载体，选择阳性克隆进行序列测定。编码mGITRL蛋白的重组质粒plRES／mGITRL为本实验室所有，将VPI基因入到plRES载体多克隆位点A(multiplecloningsiteA)中构建plRES／VPI／mGITRL和plRES／VP1。将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中，进行PCR、酶切鉴定和序列测定。(2)体内实验中，将雌性Balb／c小鼠随机分成5组，每组6只，分别是PBS组，plRES组，plRES／VPl组，plRES／mGITRL组，plRES／VPl／mGIT

6、RL组。在接种质粒前，先在股四头肌注射0．25oA的布比卡因进行预处理，连续注射3天，第四天在同一部位注射质粒DNAl00ug，接种剂量为100IIl，每两周加强免疫一次，共加强免疫三次。第三次免疫后第七天，采用ELISA检测血清中的特异性抗体水平。(3)第三次免疫后第7天处死小鼠，制备小鼠脾细胞悬液，以1．0x106／孑L的浓度加入24孔板中，于培养结束前5h加入PMA(50ng／m1)、离子霉素(1pg／m1)和莫能霉素(2pg／m1)，加入抗CD3单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体进行表

7、面标志的荧光染色，加入IL．4单克隆抗体、IFN．y单克隆抗体进行胞内细胞因子的荧光染色，通过FCM进行检测。mGITRL增强EV71．VPi基因疫苗免疫应答的实验研究结果：(1)成功构建plRES／VPI，plRES／mGITRL，plRES／VPI／mGITRL三个重组质粒，通过酶切鉴定和序列测定，能得到预期的891bp的VPI基因片段和522bp的mGITRL基因片段。(2)为了验证mGITRL是否能够诱导特异性体液免疫应答，在第三次免疫后第7天处死小鼠，用ELISA检测血清中特异性抗体水平。实验结果显

8、示，与对照组相比，plRES／VPI组和plRESNPl／mGITRL组均产生了不同程度的特异性抗体。并且，plRES／VPI／mGITRL组产生的抗体水平高于plRES／VPI组。(3)为了验证T细胞胞内细胞因子的表达，第三次免疫后第7天处死小鼠后收集脾脏细胞，以1．0×106／孑L的浓度加入24孔板中，于培养结束前5h加入PMA(50ng／m1)、离子霉素(11．tg／m1)和莫能霉素(2州m1